APLIKASI TEKNIK MEMPELAJARI SEL:

PROTEIN TRAFFICKING WITH GFP

• Agus Hendriyanto
• Arie Triani
• Sanggraha M. T.
• Lintang R.N.
• Musabaqoh M. B.
• Reza Yustian
 Elusi
• Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah
proses pemisahan fragmen DNA target dari
campuran fragmen‐fragmen DNA pengotornya.
• Fragment
• Enzim restriksi/hasil PCR
• Elektroforesis
• Memotong gel agarose yang mengandung
fragment
• Isolasi fragmen DNA dari agarose
 Ligasi
• Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan
fragmen DNA lainnya.
• T4 DNA Ligase yaitu enzim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli
yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase
yang dihasilkan oleh E.coli sendiri.
• Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan
ikatan phosphodiester yang menghubungkan nukleotida yang satu
dengan nukleotida di sebelahnya. Perbedaan dari kedua enzim
tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah
ATP sedangkan pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+
• Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan
berkomplemen.
 Transformasi
• Transformasi adalah penyisipan materi genetik
eksternal yang berupa fragmen DNA, baik DNA
kromosom maupun DNA plasmid ke dalam sel
inang.
• sel inang diharapkan akan mengalami
perubahan sifat tertentu setelah dimasuki
molekul DNA rekombinan.
 Seleksi Transforman

• Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam

sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka
kita harus melakukan seleksi untuk memilih
sel inang transforman yang membawa DNA
rekombinan. DNA rekombinan masih harus
dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang
DNA rekombinannya membawa fragmen
sisipan atau gen yang diinginkan.
 Seleksi sel rekombinan
• Seleksi sel rekombinan yang membawa
fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan
fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan
teknik PCR
PERANAN GREEN FLOUORESCENT PROTEIN?

• Bagi para peneliti, sangatlah penting untuk dapat

mengetahui dengan cepat, apakah proses
transformasi itu telah berlangsung baik atau tidak,
dan apakah gen target dapat diekspresikan tanpa
masalah.
• Gen yang menghasilkan protein yang dapat
berpendar hijau atau Green Fluorosceint Protein
(gfp) inilah yang banyak dipakai oleh para ilmuwan
sebagai gen pewarta yang aslinya berasal dari ubur‐
ubur laut.
 Mekanisme GFP
• Gen asing target yang ingin dicangkokkan ke dalam suatu
sel organisme biasanya digabungkan dengan gen gfp dalam
bentuk gen kimera atau gen gabungan, sehingga nanti
akan dihasilkan protein baru fungsional (yang menjadi sifat
baru organism tersebut) dalam bentuk protein gabungan
dengan gfp. Jadi, jika gen yang digabung dengan gen
pewarta berhasil masuk dan fungsional di dalam sel bakteri
E. coli misalnya, maka sel E. coli yang berpendar hijau di
kegelapan adalah bakteri transgenik yang fungsional yang
membawa sifat baru. Proses penapisan klon transgenik
yang positif menjadi lebih cepat dan mudah.
 Keunggulan GFP
• Untuk berpendar gfp sama sekali tidak
membutuhkan substrat
• gfp menghasilkan sinar hijau fluoresens secara
instrinsik, ketika diberi sinar eksitasi pada
panjang gelombang biru sekitar 395
nanometer. Jadi hanya dibutuhkan lampu UV
gelombang panjang atau sinar biru untuk
dapat mendeteksinya dalam kegelapan.
 Contoh aplikasi GFP
• Pada tumbuhan tembakau yang berpendar hijau
misalnya. Gen gfp diekspresikan pada virus mosaik
yang biasa menyerang tumbuhan tembakau. Banyak
hal yang masih belum diketahui tentang interaksi virus
ini dengan tembakau. Dalam proses terinfeksinya
tembakau dengan virus ini sampai tembakau menjadi
sakit lalu mati, para peneliti tanaman tidak
mengetahui lokasi awal timbulnya virus dan
penyebarannya. Dengan memasukkan virus mosaik
yang mengekspresikan gfp, maka tempat penyebaran
virus dapat terpantau hanya dengan membawa
tanaman tembakau ini ke ruang gelap dan
menyinarinya dengan lampu UV secara periodik. (Dr. Is
Helianti, MSc)
 PUSTAKA
• Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd
edition. Thomson Brooks/Cole, USA. 323 pages.
• Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka
Wirausaha Muda dan USESE Foundation, Bogor. 123
halaman.
• Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik
Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati
dan Bioteknologi – Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan
Masyarakat IPB dengan DIKTI – DIKNAS, Bogor.
• Gunawan, B. K. 2008. Skripsi: Introduksi dan Persentase Ikan Y
ang Membawa Gen Gh Growth Hormone Ikan Nila
Oreochromis Niloticus Pada Ikan Lele Dumbo Clarias Sp.
Generasi F0. Program Studi Teknologi Dan Manajemen
Akuakultur, Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan. Institut
Pertanian Bogor