BIOTEKNOLOGI

PERTANIAN

KULTUR JARINGAN
(Kultur in-vitro)

Ir. Mulat Isnaini, Ph.D

 Definisi Bioteknologi:

manipulasi, modifikasi genetik dan multiplikasi

organisme hidup dg bbr teknologi spt: kultur jaringan
(kultur in-vitro) dan rekayasa genetik  organisme
baru yg lebih baik dan dapat digunakan dalam banyak
hal yg bersifat menguntungkan.
 Alat-alat Gelas

 Gelas ukur
 Cawan Petri
 Erlenmeyer berleher lebar
 Botol media
 Beaker glas
 Pipet berbagai ukuran
 PENCIPTAAN KONDISI ASEPTIS

MUTLAK DIPERLUKAN  WHY ??

 Keberhasilan organ kultur.

 Lingk material tan mrp tempat ideal tumbuhnya mo.
 Kontaminasi terjadi dari kultur ke kultur  kematian

TUJUAN: meminimalisir mo masuk ke dalam kultur

 BENTUK KONTAMINANT

A. KONTAMINANT: Bakteri, jamur, yeast, virus

1. Bakteri  biasanya bersama explant (interior tissue)

2. Jamur  berasal dar udara (air borne) or dari tanah
(soil borne)

3. Yeast  hidup di bag luar tan & di udara

4. Viruses, mycoplasma-like organisms, spiroplasmas,
rickettsias ukuranya sangat kecil  sulit dideteksi

5. Insects  troublesome in plant cultures: semut, kutu,

and mites.
B. KONTAMINAN AWAL  datang bersama explant
krn sterilisasi yg tidak memadai/matrial yg sangat
kotor (jamur or bakteri).

C. LATENT KONTAMINAN  bakteri yg ada hingga

kultur trbentuk. Menular ke kultur yg lain.

D. INTRODUKSI KONTAMINAN krn teknik

sterilisasi yg tak benar atau kondisi laboratorium
kotor.
 PENCIPTAAN KONDISI ASEPTIS
 Syarat-syarat:

 ♦ Laboratorium :
 Ruang pertumbuhan kultur: bagian tanaman
(explant)  ditumbuhkan di dalam ruang
pemindahan steril (laminar flow)  disimpan.
Ruang simpan tdp rak-rak, lampu-lampu
flourescent, Air Condition.
 Ruang sterilisasi alat dan media:
biasanya terpisah dari laboratorium karena
alat sterilasi (autoclave).

 Transferhood steril (laminar air flow cabinet)

 Alat sterilisasi (autoclave)

 Teknik Sterilisasi

 Prosedur sterilisasi dikelompokan 3 katagori

1. Sterilisasi media dan alat-alat

2. Pemeliharaan kondisi aseptis

3. Sterilisasi bahan-bahan explant

1. Sterilsasi media dan alat-alat
Sterilisasi menggunakan uap (steam)
Alat : autoclave suhu 1210 C; tekanan 1,5
atm selama 30-60 menit.
Alat-alat gelas yang disetrilisasi dibungkus
alumunium foil atau dimasukkan ke dalam
kantong plastik tahan panas.
Untuk botol yang dilengkapi dg tutup harus
dilonggarkan tutupnya sebelum di masukkan ke
dalam autoclave.
 Sterilisasi menggunakan Filter

Alat yang digunakan adalah membran filter (milipore)

0.45-0.22 µm

Digunakan untuk bahan-bahan vitamin, asam amino,

dan toxin agar terhindar dari
mikroorganism dan virus.

Dilakukan di Laminar air flow cabinet.

 Sterilisai menggunakan Ultra Violet

Cara ini jarang dilakukan karena mahal. Tetapi radiasi

UV kadang-kadang digunakan untuk pre- sterilisasi
alat plastik disposable (cawan petri).

Dilakukan di dalam laminar flow.

 2. Pemeliharaan Kondisi Aseptis:

 Aseptis dg alkohol

 Alkohol 70% efektif untuk membasuh tangan

praktikan/peneliti sebelum melakukan
pekerjaan di Laminar air flow cabinet.

 Laminar flow sebelum digunakan harus

disemprot dg alkohol (70%) 2-3 kali.
 Aseptis dg cara di flame (dipanaskan) di atas lampu
bunsen.

Alat-alat /instrumen kecil (jarum ose, loop, pisau

skalpel, pinset dll) yg secara terus-menerus

digunakan selama bekerja harus di flame di

atas lampu bunsen.

Sebelumnya alat tsb di masukkan dulu ke dalam

alkohol 70% bbr menit.

◦
 3. Sterilisasi bahan-bahan explant
Bahan Kimia Konsentrasi Waktu Efektifitas
(min)
Sodium 1-1.4% 5-30 Sangat
hypochlorite efektif
Calcium 9-10% 5-30 Sangat
hypochlorite efektif
Hydrogen peroxide 10-12% 5-15 Efektif

Silver nitrate 1% 5-30 Efektif

Mercury chloride 0.01-1% 2-10 Memuaskan
Bromine water 1-2% 2-10 Sangat
efektif
 Sterilisasi Transfer hood
(Laminar air flow cabinet)

Explant ditumbuhkan atau ditransfer di dalam laminar

air flow cabinet.
Alat ini dilengkapi dengan ventilasi bertekanan positive,
blower, dan filter.
Ada yang dilengkapi dengan tutup / pintu plastik dan
sinar Ultra Violet (UV).

Sterilkan laminar flow dg alkohol; 70% 2-3 kali

 Media untuk pertumbuhan kultur:

Umumnya media untuk kultur:

 Murashige & Skoog (MS).
 Schenk & Hildebrandt (SH) tanaman mono dan dikotyl.
 White (White medium) akar tomat dapat
menggunakan media mengandung konsentrasi garam lebih
rendah dari pada MS medium.

Komponen Media: Tabel berikut.

END