ISOLASI KOMPONEN KIMIA PADA

EKSTRAK
ISOLASI DAN PEMURNIAN KOMPONEN
KIMIA DARI EKSTRAK TANAMAN ATAU
HEWAN, DILAKUKAN DGN. METODE :
1. CHROMATOGRAPHY METHOD
2. CUBLIMATION
3. T.A.S OVEN METHOD = Termal
Exraction, Transfer & Aplication Method for
Subtances on Mikroscale)
 Isolasi komponen kimia dalam ekstrak
tumbuhan obat dengan kromatografi :
• Kromatografi Kertas (Paper Chromatography)

• Kromatografi Lapis Tipis (Thin

Layer Chromatcgraphy = TLC)

• Kromatografi Gas (Gas Liquid Cromatography = GLC

& Gas Solid Cromatography = GSC)

• Kromatografi Kolom (Column Chromatography)

• Kromatografi Gas Tekanan Tinggi (High

Performance Liquid Cromatography = HPLC)
 Isolasi komponen kimia dalam ekstrak
tumbuhan obat dengan kromatografi :

• Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

(Preparative Thin Layer Chromatography =
Preparative TLC)

• Centrifugal Thin Layer Chromatography

• Suction Column Chromatography

• Flash Column Chromatography (Pressure Column

Chromatography)
 KROMATOGRAFI

Kromatografi merupakan suatu

metode yang cepat untuk
mengisolasi dan mengidentifikasi
(Kualitatif dan Kuantitatif)
senyawa-senyawa pada ekstrak.
Kromatografi adalah proses
terjadinya pemisahan sebagai
akibat dari partisi atau penyerapan
diantara dua fase yaitu fase
stasioner (diam) dan fase bergerak
 KROMATOGRAFI

PARAMETER PENGUKURAN UNTUK

KROMATOGRAFI KERTAS &
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ADALAH
NILAI Rf,
Jarak alir senyawa terlarut
Rf =
Jarak alir pelarut
BEBERAPA FAKTOR YANG MEMPENGARUHI
NILA Rf ;

1. STRUKTUR KIMIA SENYAWA YANG DIPISAH

2. JUMLAH CUPLIKAN
3. UKURAN PARTIKEL ADSORBEN
4. SIFAT & DERAJAT KEAKTIFAN ADSORBEN
5. KEMURNIAN DAN KONSENTRASI PELARUT
6. KEJENUHAN RUANG ELUSI
7.“KETERAMPILAN KERJA”
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
PREPARATIF

Kromatografi Lapis Tipis

Preparatip, adalah pengembangan
dan modifikasi dari kromatografi
partisi untuk mengisolasi senyawa
secara cepat dalam jumlah kecil,
yang selanjutnya diperoleh isolat
murni.
SUATU CUPLIKAN BERUPA
EKSTRAK, MIS. EKSTRAK Et2O

• Hasil KLT dgn. Eluent

C6H6 - EtOAc ( 8 : 2 )
memperlihatkan 4 noda

• Ditimbang
Mis. 1 g Ekstrak Et2O
selanjutnya dipisahkan
secara KLT PREPARATIF
 Noda
berupa pita,
diamati bila
perlu dgn.
Lampu UV
selanjutnya
diberi tanda

FRAKSI A B C D
Noda berupa pita, dikerik bersama
Si-gel, dan dilarutkan dgn pelarut FRAKSI A B C D
organik tertentu. Saring dan tampung
sebagai Fraksi-Fraksi
FRAKSI A B C D

A B C D
Hasil KLT Ekstrak Et2O
Hasil KLT masing masing Fraksi
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS 2 DIMENSI
• Kromatografi lapis tipis dua arah
dimaksudkan untuk menguji kemurnian
isolat.
• Fraksi-fraksi yang telah dipisahkan
selanjutnya didentifikasi kemurniannya
dengan KLT 2D.
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS 2 DIMENSI

• KLT 2D adalah menginjeksikan sampel

pada salah satu sudut plat KLT (ukuran sisi
sama =berbentuk bujursangkar). Mis. 10 X
10 cm.
• KLT 2D sebaiknya menggunakan 2 macam
eluen dengan kombinasi pelarut berbeda,
namun jenis yang sama.
KLT 2 DIMENSI

FRAKSI
SENYAWA
TUNGGAL AKAN
MEMBERIKAN
SATU NODA,
BAIK PADA
ELUSI PERTAMA
MAUPUN YANG
KEDUA
 Sesudah
dielusi pada
eluen I, plat
KLT diputar
90°,dielusi
kembali
pada eluen II

ELUSI I

Mis. Eluen = C6H6 - EtOAc ( 9 : 1 )

 ELUSI I
ELUSI II

Mis. Eluen = C6H6 - EtOAc ( 7 : 3 )

 ELUSI I

Mis. Eluen = C6H6 - EtOAc ( 9 : 1 )

 ELUSI I
ELUSI II

Mis. Eluen = C6H6 - EtOAc ( 7 : 3 )

 RUANG LINGKUP FITOKIMIA

SUMBER BAHAN ALAM

SIMPLISIA

EKSTRAK MEDISINAL

SENYAWA KIMIA MURNI

SENYAWA KIMIA MURNI PRAZAT

SENYAWA KIMIA SEMI

SINTESA
 BAHAN ALAM

Ekstraksi dgn. MeOH

EKSTRAK MeOH
Cairan penyari diuapkan,
KLT Suspensikan dgn.
H2O Ekstraksi dgn.
Et2O

LAPISAN H2O EKSTRAK Et2O

Ekstraksi
dgn. n-BuOH
KLT

EKSTRAK n-BuOH LAPISAN H2O

Kromatografi Kolom
KLT Kromatografi Kolom
 KROMATOGRAFI KOLOM
(Open Column Chromatography)

• KROMATOGRAFI KOLOM UNTUK

MEMISAHKAN CUPLIKAN/EKSTRAK BAHAN
ALAM DALAM JUMLAH BESAR
(KUANTITATIF)

• PRINSIP PEMISAHAN ADSORPSI DAN

PARTISI, SELANJUTNYA FRAKSINASI
KOMPONEN KIMIA SECARA SELEKTIF
 KROMATOGRAFI KOLOM
(Open Column Chromatography)
• Tabung utama berbentuk selinder, terbuat dari
kaca, diameter 10 – 50 mm, panjang 150 – 400
mm, pada bagian dasar kolom dilengkapi cakram
berpori untuk menyangga isinya.
• Tabung pengalir, diameter 3 – 6 mm, untuk
mengalirkan dan mengeluarkan cairan, dilengkapi
dengan kran untuk mengatur laju aliran.
• Batang pemampat, berupa batang aluminium
atau plastik selinder diameter ± 1 mm, untuk
memadatkan glass wool atau kapas pada dasar
kolom, diperlukan juga memadatkan adsorben
 KROMATOGRAFI KOLOM
(Open Column Chromatography)
Teknik memasukkan adsorben ke dalam kolom :
a. Cara kering
Cara ini dilakukan oleh Kirain (1980) dan Wilson.
Dalam penelitian diberi keleluasaan untuk
melakukan modifikasi.
Silika gel ditimbang, dimasukkan perlahan-lahan
ke dalam kolom kromatografi yang telah diisi
eluen, dihomogenkan, keran dibuka dan
dijalankan hingga adsorben padat.
 KROMATOGRAFI KOLOM
(Open Column Chromatography)

b.Cara basah
Silika gel yang telah ditimbang dimasukkan ke
dalam erlenmeyer yang berisi eluen, diaduk
hingga homogen. Masukkan ke dalam kolom
yang berisi eluen, keran dibuka dan dijalankan
hingga semua silika gel masuk. Keuntungan
cara basah adalah silika gel cepat merapat
memadat.
 KROMATOGRAFI KOLOM
(Open Column Chromatography)
Teknik memasukkan sampel/cuplikan :
Eluen yang berlebih diatas silika gel dalam
kolom diturunkan/dikeluarkan dahulu
sehingga permukaannya rata dengan
adsorben.
Sampel berupa ekstrak, mis. Ekstrak Eter 1
gram, dimasukkan dalam erlenmeyer,
dilarutkan dengan ± 10 ml eluen.
 KROMATOGRAFI KOLOM
(Open Column Chromatography)

Injeksikan dengan pipet khusus ke dalam

permukaan adsorben dalam kolom,
kemudian kran dibuka. Tambahkan eluen
perlahan-lahan dengan menggunakan pipet,
sementara itu kran dibuka terus, eluen
dikeluarkan (dilakukan hingga 3 kali),
kemudian ditambahkan eluen. Selanjutnya
dialirkan dengan kecepatan ± 2 tetes/menit
 KROMATOGRAFI KOLOM
(Open Column Chromatography)
Jika sampel tidak dapat dibuat suspensi, misalnya
ekstrak n-Butanol dengan perbandingan CHCl3 -
MeOH – H2O (15:6:1) maka dilakukan teknik
khusus :

• Ekstrak dilarutkan dalam metanol di dalam labu

alas bulat, jika kurang larut,
dipanaskan dengan waterbath.

• Tambahkan silika gel secukupnya (1 g : 3-4 g)

• Diuapkan di evaporator hingga kering sampai
senyawa dan silika gel bercampur
dengan baik.

• Sampel dimasukkan ke dalam kolom yang telah

diisi Si-gel, diberi lapisan kertas saring pada
bagian atas yang digunting bulat.

• Eluen dimasukkan sedikit-sedikit sambil keran

dibuka.
 KROMATOGRAFI KOLOM
BERTEKANAN
1. Suction Column = Vacum Liquid
Chromatography
Prinsip : Adsopsi dan partisi

Suction Column memisahkan

komponen-komponen kimia dengan
cepat, mempunyai kelebihan karena
dalam waktu 20-30 menit dapat terjadi
pemisahan.
2. Flash Column
Flash Column untuk memisahkan dua-tiga
senyawa, mirip dengan kolom biasa, hanya
dipercepat dengan tekanan.
Flash Column dapat juga digunakan untuk
pemisahan komponen kimia Biota laut secara
cepat, sering juga disebut Rapid Sigel Column
Chromatography, adsorbent yang digunakan
berdiameter lebih kecil dibanding pada
adsorbent pada kromatografi kolom biasa.
ROTARI EVAFORATOR
 PROSES ISOLASI DGN
KOLOM KROMATOGRAFI
HASIL KOLOM KROMATOGRAFI
BERUPA FILTRAT DITAMPUNG DLM
BOTOL KECIL, MASING-MASING
DIIDENTIFIKASI DGN. KLT, SPOTS
YANG SAMA DIKUMPULKAN
DALAM BENTUK FRAKSI-FRAKSI.
FRAKSI-FRAKSI YANG MEMPERLIHATKAN
NODA TUNGGAL PADA KLT, DILANJUTKAN
KLT 2D.
FRAKSI DENGAN BEBERAPA NODA
DIKUMPULKAN, DIUAPKAN DAN DIULANGI
PEMISAHANNYA DENGAN KOLOM YANG
LEBIH KECIL.
 BAGAIMANA SENYAWA BIOAKTIF DIISOLASI
DARI BAHAN ALAM…?
•Bioassay guided extraction, partition, fractionation
•Phytochemical study (random, chemotaxonomic)
BAHAN
BAHAN
ekstraksi
EKSTRAK
EKSTRAK Fractionation

fraksinasi Fraksi Fraksi Fraksi Fraksi

Fraksi Fraksi Fraksi Bioassay

Fraksi aktif (LD-50)
isolasi
Isolation
Seny. 1 2 3 4 5 6 7 dst.
Seny. 1 2 3 4
Bioassay thd. 1-7
Bioassay thd. Paling aktif
Uji bioaktivitas
Uji penghambatan thd. sel kanker
 KRISTALISASI
• FRAKSI YANG MEMPERLIHATKAN NODA
TUNGGAL PADA KLT2D,
FILTRAT DIUAPKAN HINGGA KERING,
RESIDU DITAMBAHKAN PELARUT
TERTENTU MIS. MeOH, JIKA PERLU
DIPANASKAN (W.B), DIMASUKKAN DALAM
LEMARI ES, HINGGA MEMBENTUK KRISTAL
DLM. LARUTAN
• BILA TIDAK MEMBENTUK KRISTAL, MAKA
PELARUT DIUAPKAN LAGI, RESIDU
KEMBALI DILARUTKAN DENGAN PELARUT
LAIN DENGAN PERLAKUAN YANG SAMA.
 PROSEDUR ISOLASI DAN ELUSIDASI
EKSTRAK / ISOLASI :
FRAKSI - Kromatografi Kolom
- Kromatografi Lapis Tipis
- High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
- DLL.

SENYAWA MURNI
OH

HO 12 COOCH3

O
13 ELUSIDASI STRUKTUR :
CH2OH 1
OCOCH C - Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
9
O O 15 23 - Mass Spectroscopy (MS)
OH 4 6 - UV-Spectroscopy
O O
OH
O - Infrared Spectroscopy
H H
OH - Polarimeter
- DLL.
Bruceoside - A (39)
 ELUSIDASI STRUKTUR KIMIA

Dari Hasil Ekstraksi suatu Tanaman

Buah Brucea decintricana,
Pada lapisan Et2O, dipisahkan secara
kromatografi kolom, terdapat Empat Fraksi.
Fraksi fraksi dapat dikristalkan.

Kristal Senyawa baru tersebut

selanjutnya diidentifikasi
 Brucea decintricana
Ekstraksi dgn. MeOH
EKSTRAK MeOH
Cairan penyari diuapkan,
Suspensikan dgn. H2O
Ekstraksi dgn. Et2O

LAPISAN H2O EKSTRAK Et2O

Ekstraksi Kromatografi
dgn. n-BuOH Kolom

EKSTRAK n-BuOH SISA H2O A B C D

KRISTALISASI

SENYAWA MURNI
1. TETAPAN FISIS

Melting Point (mp) ;147º - 148º

(from Hexane)
“dengan menggunakan pelarut
Heksan, diperoleh titik lebur 147º
(mulai melebur) dan 148º (melebur
total)

ALAT : TYLLE
 • Putaran Optik

[α] 16D + 149º (c = 0.67 in CHCl3 )

senyawa tsb. Mempunyai putaran optik α,

menggunakan lampu Deutorium, pada
suhu 16º, didapatkan putaran optik ke
kanan (+) sebesar 149º dengan
konsentrasi 0,67 dalam Kloroform
2. ANALISIS SPECTROSCOPY :

• Mass Spectroscopy (MS)

• Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
• Infrared Spectroscopy
• UV-VIS Spectroscopy
• MASS SPECTRO
Menentukan Berat Molekul dan Jumlah
Fragmentasi Molekul Senyawa

C = 22 X 12 = 264
H = 36 X 1 = 36
O = 4 X 16 = 64
BERAT MOLEKUL SENYAWA
TERSEBUT = 346
{ M+ = 346 }
• NMR; Nuclear Magnetic Resonances
¹H-NMR = Proton NMR
Menentukan banyaknya atom H dan
letak atom H
¹³C-NMR = Carbon NMR
Menentukan jumlah, letak atom C
serta lingkungan atom C tersebut
• SEMUA “INTI” BERMUATAN,
• “INTI” BERSPIN PD SUMBU DGN DIPOL
MAGNET
• SETIAP PROTON & NEUTRON BERSPIN
MENURUT SUMBUNYA.
(DINYATAKAN BILANGAN SPIN I)
HARGA = 0, ½, 1, ³/2 , ……
BILA JUMLAH PROTON DAN NEUTRON =
- BILANGAN BULAT GENAP, MAKA HARGA
I = 0 ~ TIDAK MEMBERIKAN ISARAT.
- BILANGAN GANJIL, MAKA HARGA I = ½ ,
³/2 , …. MEMBERIKAN ISARAT
• IR Spectroscopy
– Analisis Gugus fungsi yang terdapat dlm
senyawa
– Gambaran macam dan jumlah gugus
fungsi dalam senyawa tersebut.
– Vibrasi molekul menunjukkan ikatan-ikatan
molekul dalam senyawa tersebut
– ENERGI VIBRASI DIDETEKSI OLEH
SPECTRUM IR
KBr
IR V ‾ ¹ : 3400 (-OH), 1680 (C=O),
max cm

1640, 990 (Vinyl group)

 OH O H

HO 12 COOCH3
13 C O O C 3H
O O H HO
CH2OH 1
OCOCH C
O O 9 O
15 23 O H
O H
OH 4 6
OH O O
O O H
H H
OH

O O

Bruceoside - A (39) H H

OH B ru c e in E (42)
(

OH
COOCH3
OH HO
HO COOCH 3
O
O
O OH C
O OCOCH

OH
CH2OH O
O O O
O O
H H
H H OH
OH

Brucein D (41) OH Bruceoside B (40)

 PROSEDUR ISOLASI DAN ELUSIDASI
EKSTRAK / ISOLASI :
FRAKSI - Kromatografi Kolom
- Kromatografi Lapis Tipis
- High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
- DLL.

O
H3CO SENYAWA MURNI
O

HO
Benzyl ferulate
ELUSIDASI STRUKTUR :
- Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
- Mass Spectroscopy (MS)
H3CO O
- UV-Spectroscopy
- Infrared Spectroscopy
- Polarimeter
- DLL.
OH O

Pinostrobin