SIDANG SKRIPSI

IDENTIFIKASI MARKER APOPTOSIS PADA

KEHAMILAN PREEKLAMPSIA DAN KEHAMILAN
NORMOTENSIF DI KOTA JAMBI

Oleh:
Sarah Mardiyah - G1A117068
Pembimbing 1 : dr. Rina Nofri Enis, M.Sc
Pembimbing 2 : Dr. dr. Herlambang, Sp.OG., KFM
Penguji 1 : dr. Damayanti Eka Fransiska Malau, Sp.OG
Penguji 2 :
BAB 1 - PENDAHULUAN

■ Latar Belakang

↑AKI AKB
PREEKLAMPSIA
500.000
neonatal
SDKI 2012 76.000 ibu
AKI : 359/100.000 KH
Negara Maju
2-5%
Negara
Berkembang
Mortalitas 1,8-17%
dan
morbiditas
di Dunia
 Kegagalan Invasi Hipoksia dan Iskemia
Trophoblas Plasenta

Disfungsi Endotel Stress Oksidatif

Aktivasi Apoptosis ↑↑↑

Apoptosis : Programmed Cell

Death

Jalur Intrinsik : BAX dan Bak

PREEKLAMPSIA
Jalur Ekstrinsik : death receptors;FAS
■ Rumusan Masalah

Identifikasi marker apoptosis pada kehamilan preeklampsia

dan kehamilan normotensif di Kota Jambi.

Tujuan Umum
■ Tujuan Penelitian

Tujuan Khusus :
1. Untuk mengidentifikasi marker
apoptosis yaitu FAS dan BAX
pada kehamilan preeklampsia.
2. Untuk mengidentifikasi marker
apoptosis yaitu FAS dan BAX
pada kehamilan normotensif.
 Manfaat Akademis:
Sumber informasi ilmiah,
lebih memahami patogenesis
preeklampsia dan sebagai data
dasar untuk penelitian
■ Manfaat Penelitian selanjutnya

Manfaat Praktis :
Bahan informasi sehingga
dapat meningkatkan upaya
pencegahan dan upaya
menurunkan angka kejadian
preeklampsia

Manfaat Masyarakat :
Informasi mengenai preeklampsia
BAB 2 – TINJAUAN PUSTAKA

• ↑ TD sistolik ≥140 mmHg dan

TD diastolik ≥90 mmHg setelah
usia kehamilan 20 minggu
dan
Preeklampsia
• Tanda-tanda kerusakan sistem
organ
Atau
• Proteinuria
 Paritas (Nulipara)

Usia ibu (<20 tahun atau >35 tahun)

Faktor resiko Riwayat Penyakit

Riwayat Keluarga dengan

Preeklampsia

Komorbiditas
 Patogenesis Preeklampsia

■ Teori Intoleransi Imunologik

– Human leukocyte antigen protein G (HLA-G)
■ Teori Iskemia Plasenta dan Disfungsi Endotel
■ Teori Radikal Bebas dan Stress Oksidatif
Patogenesis

Invasi Trophoblas Abnormal

Kegagalan Remodelling A. Spiralis

↓ Aliran darah uteroplasenta

Hipoksia dan Iskemia Plasenta

Stress Oksidatif & Disfungsi Endotel

Pelepasan produk toksin ke sirkulasi Kerusakan DNA
Diagnosis Preeklampsia

International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy

↑TD sistolik ≥140 mmHg dan/atau tekanan darah diastolik ≥90
mmHg pada ibu yang sebelumnya normotensif, dan disertai oleh
satu atau lebih gejala berikut:
• Proteinuria (≥30 mg/mol, protein: rasio kreatinin; ≥300 mg /24
jam; atau ≥2 + dipstick)
• Disfungsi organ ibu lainnya, termasuk: cedera ginjal akut;
gangguan fungsi hepar, dengan atau tanpa nyeri perut kuadran
kanan atas atau epigastrik; komplikasi neurologis; atau
komplikasi hematologis; atau,
• Disfungsi uteroplasenta.

Komplikasi Preeklampsia

Meliputi kematian ibu dan janin, solusio plasenta, edema paru,

gangguan ginjal akut, Sindroma HELLP dan eklampsia.
 Kerangka Teori
Intoleransi Imunologik Kelainan Vaskularisasi
HLA-G Plasenta

Invasi Trofoblas Abnormal

Kegagalan Remodelling A.Spiralis

Hipoperfusi Uteroplasenta

Hipoksia & Iskemia Plasenta

Peningkatan Stress Oksidatif

Disfungsi Endotel
Pembuluh Darah
 Kerusakan DNA Pelepasan produk toksin

Aktivasi Bax Aktivasi Fas

Peningkatan Permeabilitas
Mitokondria Terhadap Sitokrom C

Aktivasi Caspase

Apoptosis

Peningkatan Apoptosis

Gejala Klinis Preeklampsia

 Kerangka Konsep

Ekspresi Protein Bax & Fas  

Ekspresi Protein Bax dan Ekspresi Protein Bax dan

Fas Tidak Meningkat Fas Meningkat

Kehamilan Normotensif Kehamilan Preeklampsia

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

Jenis dan Rancangan Penelitian

Deskriptif Analitik Case-Control

Tempat dan Waktu Penelitian

RSUD Raden Mattaher Jambi.
Laboratorium Biomolekul Fakultas Kedokteran Universitas
Jambi.
Juni 2020 sampai dengan bulan September 2020.

Populasi
wanita hamil yang didiagnosis
preeklampsia dan wanita hamil Sampel
normotensif dengan usia teknik purposive
kehamilan > 20minggu, di RSUD sampling
Raden Mattaher.
■ Kriteria Inklusi
– Wanita post partum dengan diagnosis preeklampsia dan
kehamilan normotensif setelah usia kehamilan > 20
minggu.
– Menyetujui untuk mengikuti penelitian.

■ Kriteria Eksklusi
– Rekam medik tidak lengkap.
– Memiliki tanda infeksi akut berdasarkan
anamnesis/pemeriksaan fisik.
– Pasien dengan penyakit penyulit lain (hipertiroid,
decompensasi cordis, HELLP sindrom, dan gagal ginjal).
Sampel Penelitian

Keterangan:
n1 = jumlah wanita hamil dengan preeklampsia
n2 = jumlah wanita hamil tanpa preeklampsia
α (2 arah) = tingkat kemaknaan = 0,05  Zα = 1,96 power = 80% 
Zβ=0,0842
P1 = proporsi wanita hamil dengan preeklampsia = 0,17 (literatur 1,8%-
17%)
P2 = proporsi wanita hamil tanpa preeklampsia = 0,83
P = ½ (P1+P2) = 0,5
Q = 1-P =0,5  Q1 = 0,9 : Q2 = 0,1
n1 = n2 = 16
Jumlah sampel minimal yang dibutuhkan adalah 16 sampel untuk masing-
masing kelompok.
Dengan kemungkinan drop out sampel adalah 10%. Maka, jumlah
sampel yang dihitung adalah sebagai berikut:

Keterangan:
n’ = jumlah sampel yang dihitung
n = jumlah sampel minimal
f = perkiraan proporsi drop out (10%)

Berdasarkan perhitungan besar sampel ditambah dengan kemungkinan

drop out 10% didapatkan besar sampel 18 sampel untuk kehamilan
preeklampsia dan 18 sampel untuk kehamilan normotensif.
Definisi Operasional Variabel
Prosedur Penelitian
Pengambilan Sampel

Sampel primer: plasenta 

informed consent  Data sekunder: data rekam
Departemen obstetri dan medik  Rekam medik
ginekologi RSUD Raden RSUD Raden Mattaher Jambi
Mattaher Jambi

• Sampel jaringan plasenta daerah korion potong jaringan

plasenta  2 area sentral dan 2 area lateralmasukkan ke
tube eppendorf RNAlaterTM
• Sampel disimpan pada suhu -20oC.
 Isolasi RNA
Isolasi RNA menggunakan kit promega RNA (ReliaPrep, USA).
1. Aliquot DNAse, bagi ke 4 tube ukuran 1,5 ml. Simpan di suhu -20oC.
2. Tambahkan 1 ml β-mercaptoethanol (BME) pada RNA lysis buffer 50 ml.
Simpan di suhu 4 oC
3. Tambahkan 100 ml 95% etanol pada RNA wash solution.
4. Tambahkan 8 ml 95% etanol pada DNA stop solution.
Preparasi sampel;
5. Masukkan 175 µl lysis buffer ke tube eppendorf ukuran 1,5 ml.
6. Gerus sampel jaringan dengan mortar dan lumpang, masukkan ke dalam
tube yang sudah diberi label sampel.
7. Tambahkan 350 µl RNA dilution buffer .
8. Waterbath 70°C selama 3 menit. Sentrifugasi 14.000 xg 10 menit.
9. Clear lisat hasil sentrifugasi dipindahkan ke spin column
10. Tambahkan 200 µl etanol 95% ke dalam spin column. Sentrifugasi.
8. Buang cairan di collection tube, tambahkan 600 µl RWA, Sentrifugasi.
9. Siapkan DNase incubation mix.
Yellow core buffer 40 µl
MnCl2 0,09 M 5 µl
DNase I Enzyme 5 µl
9. Masukkan DNase incubation mix ke spin column, inkubasi 15 menit.
10. Tambahkan 200 µl DNA stop solution, sentrifugasi.
11. Tambahkan 600 µl RWA, Sentrifugasi.
12. Tambahkan 250 µl RWA, Sentrifugasi.
13. Pindahkan spin column ke elution tube, Tambahkan 100 µl nuclease free
water. sentrifugasi.
14. Simpan RNA dielution tube dalam suhu -20°C
 Sintesis CDNA
cDNA diperoleh menggunakan Kit GoTaq 2-Step RT-Qpcr System

1. Membuat Reverse Transcriptase

mix dalam tube PCR;
RNA 7µg,
Primer oligo (dT) 1 µl.
Random primer 1 µl.
Nuclease Free Water 1µl
waterbath pada suhu 70ºC selama 5 menit. inkubasi di chiller 4ºC selama 5 menit,
dan simpan di freezer -20ºC.
2. Siapkan mix GoScript reaction; dan Campur 10 µl ke tube RT primer.
– Nuclease Free Water 1,5 µl
– Go script 5x reaction buffer 4 µ
– MgCl2, 25 mM 2 µl
– PCR nucleotide mix, 10 mM 1 µl
– Recombinan Rnasin 0,5 µl
– Ribonuclease inhibitor Go script reverse transkrip 1 µl
3. PCR,
4. Simpan freezer dengan suhu -20oC
 Real Time Polymerase Chain Reaction
1. Komponen master mix (untuk 1 gen)
GoTaq PCR mix 10
Primer F 2
Primer R 2
Dye REF C541A 0,2
Nuclease Free Water 2,8
cDNA 3
2. Tambahkan reaksi mix tanpa DNA templet ke reaction plate.
3. Tambahkan cDNA 3 µl ke reaction plate yang telah diisi dengan master mix.
4. Lakukan optimasi qPCR dengan langkah sebagai berikut:
 BAX Siklus Suhu Waktu
GoTaq Activation 1 95°C 2 menit
Denaturation 40 95°C 15 detik
Annealing 40 60°C 1 menit
Dissociation 1 60°C 2 menit
FAS Siklus Suhu Waktu
GoTaq Activation 1 50°C 2 menit
95°C 2 menit
Denaturation 40 95°C 15 detik
Annealing 40 60°C 1 menit
Dissociation 1 60°C 1 menit
GAPDH1 Siklus Suhu Waktu
GoTaq Activation 1 95°C 5 menit
Denaturation 55 95°C 10 detik
Annealing 55 60°C 20 detik
Dissociation 1 72°C 10 detik
Primers yang digunakan untuk running qPCR adalah primers gen
target dan primer gen GAPDH (housekeeping gene) yang berperan
sebagai internal kontrol untuk menilai ekspresi gen target;

BAX Forward:5ʹ-CCTTTTCTACTTTGCCAGCAAAC-3ʹ
Reverse :5ʹ-GAGGCCGTCCCAACCAC-3ʹ
FAS Forward : 5'-CAAGGGATTGGAATTGAGGA-3'
Reverse : 5'-ACCTGGAGGACAGGGCTTAT-3'

GAPDH Forward: 5ʹ-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’

Reverse: 5ʹ -GCCCAATACGACCAAATCC-3’
 Pengolahan Data
CODIN CLEANING
EDITING PROCESSING
G

Analisis Data :

Analisis
Normalisasi
Metode Data
Univariat
Livak (SPSS) &
Bivariat

Etika Penelitian

FKIK Univeristas Jambi & RSUD Raden Mattaher

informed consent
(Anonymity & Confidentiality)
 Alur Penelitian

Kehamilan Kehamilan
Preeklampsia Normotensif

Informed consent

Pengambilan Sampel
Plasenta
 Real Time Polymerase Chain
Reacion

Ekspresi FAS Ekspresi BAX

Analisis Data
Hasil Penelitian
Distribusi sampel penelitian berdasarkan karakteristik sampel
Kelompok Penelitian
Variabel Kehamilan Kehamilan Normotensif
Preeklampsia
f % F %
Usia Ibu
Risiko Tinggi (<20th dan >35 th) 7 38,9 8 44,4
Risiko Rendah (20th - 35 th) 11 61,1 10 55,6
Usia Kehamilan
Preterm (<37 minggu) 7 38,9 3 16,7
Aterm (37-42 minggu) 11 61,1 15 83,3
Posterm (>42 minggu) 0 0 0 0
Paritas
Nulipara 7 38,9 6 33,3
Primipara 3 16,7 4 22,2
Multipara 8 44,4 8 44,4
Grandemultipara 0 0 0 0
Total 18 100 18 100
 Distribusi sampel penelitian berdasarkan karakteristik usia ibu
Kelompok Penelitian
Kehamilan Kehamilan
Variabel
Preeklampsia Normotensif
f % F %
Usia Ibu
Risiko Tinggi (<20th 7 38,9 8 44,4
dan >35 th)
Risiko Rendah (20th - 11 61,1 10 55,6
35 th)

Kumari et al. 2016 Bakaro General Hospital Jharkhand

• Jumlah kasus Preeklampsia terbanyak adalah usia risiko rendah

Karta et al. 2016 Rumah Sakit Achmad Mochtar Bukittinggi

• Jumlah kasus Preeklampsia terbanyak adalah usia risiko tinggi
Distribusi sampel penelitian berdasarkan karakteristik usia Kehamilan
Kelompok Penelitian
Kehamilan Kehamilan
Variabel
Preeklampsia Normotensif
f % F %
Usia Kehamilan
Preterm (<37 minggu) 7 38,9 3 16,7
Aterm (37-42 minggu) 11 61,1 15 83,3
Posterm (>42 minggu) 0 0 0 0

Milln et al. 2020. di National

Referal Hospital Uganda.
Aterm 57,55%.
Karima et al. 2015. di RSUP
Dr. M. Djamil Padang. Aterm Pragitara et al. 2020. di Dr.
64,8%. Soetomo Academic Hospital.
Preterm 62,86%.
Distribusi sampel penelitian berdasarkan karakteristik status paritas
Kelompok Penelitian
Kehamilan Kehamilan
Variabel
Preeklampsia Normotensif
f % F %
Paritas
Nulipara 7 38,9 6 33,3
Primipara 3 16,7 4 22,2
Multipara 8 44,4 8 44,4
Grandemultipara 0 0 0 0

Kusumastuti et al. 2019. di

Puskesmas Jepang, Kudus.
Multipara 60%.
Budi et al. 2015. di RSUP Sanglah
Denpasar. Nulipara 49,7%.
Rana et al. 2019. Nulipara faktor
risiko PE.
Rerata Ekspresi Bax Berdasarkan Kelompok Penelitian
Ekspresi Bax
Kelompok penelitian P value
Mean±SD
Preeklampsia 2,42±2,34
P = 0,02
Kehamilan Normotensif 4,32±2,44

∆Cq values Bax

∆Cq (Kasus)1 ∆Cq (Kontrol)2 Fold
Gen Target ∆∆Cq3
change4
n=18 n=18
BAX/GAPDH 2,42 4,32 -1,9 3,73

Keterangan:
1
∆Cq Kasus = Cq gen target – CqGAPDH
2
∆Cq Kontrol = Cq gen target – CqGAPDH
3
∆∆Cq = ∆Cq Kasus - ∆Cq Kontrol
2
4 ^-(∆∆Cq)
= Fold change
Rerata Ekspresi Fas Berdasarkan Kelompok Penelitian
Ekspresi Fas
Kelompok penelitian P value
Mean±SD
Preeklampsia 2,74±3,30
P = 0,04a
Kehamilan Normotensif 1,61 ±4,78

∆Cq values Bax

∆Cq ∆Cq
(Kasus)1 (Kontrol)2 Fold
Gen Target ∆∆Cq3
change4
n=18 n=18
FAS/GAPDH 2,74 1,61 1,12 0,45
Keterangan:
1
∆Cq Kasus = Cq gen target – CqGAPDH
2
∆Cq Kontrol = Cq gen target – CqGAPDH
3
∆∆Cq = ∆Cq Kasus - ∆Cq Kontrol
2
4 ^-(∆∆Cq)
= Fold change