IV.

Rekombinasi DNA

1
 SAP BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

• Enzim restriksi dan Vector

• Isolasi, pemotongan dan penyambungan DNA
• Produksi protein eukariotik pada bakteri
• Transformasi dan seleksi

2
 Latar Belakang

 Metode pemuliaan (breeding) jasad secara

konvensional dilakukan dengan melakukan
persilangan jasad pada aras individu, bukan pada aras
genom jasad
 Contoh I : metode pemuliaan tanaman dilakukan
dengan menyilangkan suatu tanaman dengan
tanaman lain yang sekerabat secara penyerbukan
silang atau penyambungan bagian-bagian tanaman 
hasil akhir tidak pasti karena rekombinasi genetik
tidak dapat dikendalikan
 Contoh II : teknik mutagenesis, hasil akhir seringkali
tidak sesuai harapan

3
Rekombinasi DNA secara alami

4
Mutasi : perubahan struktural atau komposisi
DNA pada genom suatu jasad yang dapat
menyebabkan terjadinya perubahan fenotipik
pada jasad tsb  terjadi karena :
 faktor luar (radiasi, senyawa kimia atau
perlakuan fisik tertentu)
 secara alami (kesalahan dalam proses
replikasi DNA)
 tidak melibatkan pertukaran elemen
gentik yang spesifik
5
• Terjadinya rekombinasi secara alami
menyebabkan gen dapat berpindah dari satu
organisme ke organisme lain yang berkerabat
dekat
• Dengan kemajuan teknologi molekuler,
perpindahan gen dapat terjadi antar organisme
yang sama sekali tidak berkerabat dekat
• Misalnya : gen manusia dipindahkan ke bakteri
• Perpindahan tsb mengakibatkan terbentuknya
molekul DNA yang berasal dari sumber yang
berbeda dan dapat digabungkan DNA
REKOMBINAN
6
 Teknologi DNA Rekombinan

• Teknologi pengubahan sifat-sifat genetik suatu jasad

 berawal dari keberhasilan penyambungan
molekul DNA secara in vitro pertama kali oleh Paul
Berg pada awal 1970an
• Teknik menggabungkan molekul-molekul DNA secara
in vitro sehingga diperoleh molekul DNA rekombinan
sesuai yang diharapkan
• Secara umum disebut sebagai rekayasa genetik
(genetic engineering) atau kloning DNA

7
 Teknologi DNA Rekombinan
• Molekul-molekul DNA yang berasal dari jasad yang
hubungan kekerabatannya sangat jauh dapat
digabungkan menjadi suatu molekul DNA
rekombinan yang membawa sifat-sifat genetik baru
• Kombinasi DNA yang berasal dari dua organisme
yang berbeda : Bakteri dan manusia
Bakteri dan tanaman
Virus dan manusia
• Dapat mengatasi inkompatibilitas (ketidaksesuaian)
genetik pada pemuliaan secara konvensional

8
 Contoh produk rekombinan

• Produk pertanian : tanaman tahan penyakit

9
10
11
12
13
Rekombinasi Alami Rekombinasi Buatan

14
 Rekombinasi DNA
• Merupakan proses pertukaran elemen genetik antara untaian
DNA yang berlainan atau antara bagian-bagian gen yang terletak
dalam satu untaian DNA.
• Tahapan dasar rekombinasi DNA secara in vitro
1. Isolasi molekul DNA (gen) yang akan digabungkan
2. Pemotongan DNA menggunakan enzim endonuklease restriksi
3. Penyambungan molekul-molekul DNA menggunakan enzim
DNA ligase ke dalam suatu molekul DNA vektor
4. Transformasi sel inang dengan DNA rekombinan hasil ligasi
5. Analisis dan konfirmasi keberadaan DNA rekombinan dalam sel
inang (seleksi)
6. Karakterisasi fungsional gen yang akan diklon

15
Perangkat utama yang digunakan pada
pembentukan DNA rekombinan:

• Enzim restriksi
• Enzim DNA ligase
• Plasmid
• Sel inang

16
 Enzim endonuklease restriksi

• Ditemukan oleh Werner & Hamilton tahun 1960 dari

mikroba
• Mengenal dan memotong DNA pada sekuen spesifik
dengan panjang 4 – 6 pasang basa
• Dihasilkan secara alami oleh bakteri untuk
menghancurkan DNA fage yang menginfeksi
• Ada banyak enzim restriksi yang telah ditemukan dan
diisolasi dari berbagai spesies bakteri

17
 Enzim endonuklease restriksi

• Namanya diawali dengan tiga huruf nama bakteri

yang menghasilkan enzim tsb
• Mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas
 bagian DNA yang dipotong disebut sekuen
pengenal
• Sekuen pengenal adalah urutan basa tertentu yang
dikenali oleh enzim restriksi sebagai tempat yang
akan dipotongnya

18
 Contoh enzim restriksi : EcoR1

• Penamaan enzim EcoR1

• E = genus (Escherichia)
• co = species (coli)
• R = strain
• 1 = urutan enzim yg ditemukan
pd bakteri
• Diisolasi dari bakteri E.coli
• Ujung “lengket” (sticky ends)
• Ujung “tumpul” (blunt ends)

19
20
 Contoh enzim restriksi : EcoR1
• Jika urutan semacam ini dipotong oleh enzim EcoR1 maka
hasilnya :

5’ - G A A T T C -3’
3’ - C T T A A G -5

• Anak panah menggambarkan letak pemotongan oleh enzim

EcoR1 sehingga dihasilkan potongan dengan ujung kohesif :
5’ - G 5’ - A A T T C -3’
3’ - C T T A A -5 G -5
• Ujung kohesif : ujung-ujung yang mudah membentuk ikatan
komplementer seperti semula jika potongan DNA tsb
disambung lagi menggunakan enzim DNA ligase
21
Ujung “lengket” dan “tumpul”
(Blunt & Sticky ends)
23
 Enzim DNA Ligase

• Enzim yang mengkatalisis reaksi pembentukan

kembali ikatan fosfodiester antara potongan
fragmen DNA atau RNA berujung kohesif yang saling
komplemen hasil pemotongan oleh enzim restriksi

24
25
26
27
 Sel inang

• Bakteri Escherichia coli, Bacillus subtilis dan khamir

Saccharomyces cerevisiae  ideal sebagai sel inang
bagi gen yang akan dikloning karena mudah
dimanipulasi, tumbuh cepat dan stabil pada medium
kultur biasa, non patogen dan dapat ditransformasi
DNA asing
• Bakteri E.coli paling banyak digunakan sebagai sel
inang dalam penelitian kloning dan ekspresi karena
berbagai gen asing yang mengkode protein target
dapat diterima dan diekspresikan oleh E.coli

28
 VEKTOR
• Berperan membawa molekul DNA asing yang akan
dimasukkan ke dalam sel target
• Berupa plasmid bakteri atau viral DNA
• Plasmid : elemen genetik ekstra kromosomal pada
berbagai spesies bakteri
• DNA untai ganda berbentuk sirkuler tertutup
• Bereplikasi secara otonom di dalam sel sehingga
dapat memperbanyak molekul DNA asing yang
disisipkan di dalamnya

29
Plasmid dan DNA digabungkan dengan enzim ligase

30
31
32
33
 Komponen-komponen Vektor
1. ori (origin of replication), titik awal replikasi – urutan
nukleotida pada vektor yang digunakan untuk mengawali
proses replikasi DNA vektor tsb
2. Sisi penyisipan fragmen DNA asing – sekuen DNA pada
vektor yang dapat dipotong oleh enzim restriksi tertentu
sehingga dapat digunakan untuk menyisipkan fragmen DNA
asing yang diklon  sisi kloning (cloning site)
3. Penanda genetik (genetic marker) – suatu gen tertentu
pada vektor yang digunakan untuk menentukan koloni sel
yang membawa DNA vektor atau DNA rekombinan
4. Sinyal transkripsi dan translasi – urutan nukleotida yang
ditambahkan pada vektor untuk ekspresi gen yang disisipkan

34
 VEKTOR

Pembuatan plasmid dan mekanisme penyisipan gen

35
36
Isolasi, pemotongan dan
penyambungan DNA

37
 Isolasi DNA

• Suatu teknik memperoleh DNA murni (tanpa

protein dan RNA) dari suatu sel dalam jaringan
• Sel eukaryotik harus dihancurkan secara
mekanik dan enzimatis karena membran sel
dari membran inti sebagian besar tersusun
atas lipida
• DNA berada dalam sel sehingga untuk
mendapatkanya harus merusak dinding dan
membran sel

38
 TAHAPAN ISOLASI DAN PURIFIKASI DNA

1. Perusakan dinding sel dan membran sel

(lisis sel)
2. Inactivasi Enzim DNA-se
3. Purifikasi DNA dari komponen lain
• Ekstraksi/presipitasi
• Kromatografi Adsorpsi
4. Pencucian dan resuspensi
 Kit Isolasi DNA
Isolasi DNA juga dapat dilakukan menggunakan kit
yang diproduksi untuk mempermudah dan
mempercepat proses isolasi DNA. Kit isolasi DNA
disesuaikan dengan kebutuhan dan jenis sel yang
digunakan

40
1. Perusakan dinding dan membran sel
Untuk merusak dinding sel dengan tujuan mengeluarkan
isi sel, dapat dilakukan dengan cara:
•Mekanik (menggerus sampel dengan mortar dan pestle
dalam nitrogen cair), mesin micro smash, sonikasi
•Enzimatik (menggunakan proteinase K)
•Kimiawi (menggunakan detergen  dapat melarutkan
lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi
membran sel

micro smash
Lisis sel

42
2. Ekstraksi DNA dengan buffer ekstraksi/lisis

Ekstraksi DNA : memisahkan DNA dari komponen seluler

lainnya
Buffer ekstraksi/lisis berfungsi:

1.Merusak membran sel

2.Menginaktivasi enzim DNA-se
3.Menghilangkan kontaminan lain
Contoh Buffer ekstraksi/lisis:
-Buffer TES ( Tris-HCl pH 8, EDTA 10 mM, NaCl 0,5M , SDS
1%)
2. Ekstraksi DNA dengan buffer ekstraksi/lisis
Ekstraksi DNA : memisahkan DNA dari komponen seluler lainnya
menggunakan buffer ekstraksi
Contoh Buffer ekstraksi/lisis:
-Buffer TES ( Tris-HCl pH 8, EDTA 10 mM, NaCl 0,5M , SDS 1%)
Fungsi Buffer ekstraksi/lisis :
1.Merusak membran sel
2.Menginaktivasi enzim DNA-se yang dapat mendenaturasi DNA
3.Menghilangkan kontaminan lain (komponen penyusun sel seperti
polisakarida dan protein) agar diperoleh DNA murni 
menggunakan fenol untuk denaturasi protein menyebabkan protein
kehilangan kelarutan dan mengalami presipitasi sehingga dapat
dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi.
2. Ekstraksi DNA dengan buffer ekstraksi/lisis
Hasil sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni
1.fase organik pada lapisan bawah (pelet)
2.fase aquoeus (air) pada lapisan atas (supernatan)
•DNA dan RNA berada pada fase aquoeus,
•protein yang terdenaturasi berada pada interfase
•lipid berada pada fase organik
•RNA dipisahkan dari ekstrak DNA dengan RNAse
46
47
3. Purifikasi (pemisahan DNA)

• Setelah proses ekstraksi, DNA yang diperoleh dipekatkan melalui presipitasi

(pemisahan) menggunakan etanol atau isopropanol
• Setelah dilakukan sentrifugasi, kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi
DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber
dan terbentuk pellet
• presipitasi juga berfungsi menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal
dari tahapan ekstraksi.
• DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang
masih tersisa. Residu tersebut juga mengalami koagulasi namun tidak
membentuk struktur fiber dan berada dalam bentuk presipitat granular.
• Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet dikeringanginkan dalam
tabung, pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.
• Proses presipitasi kembali dengan etanol atau isopropanol sebelum pellet
dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi
3. Purifikasi dg Ekstraksi/Presipitasi
Tahap 1: Ekstraksi dg pelarut organik
Aqueous

sentrifugasi Fasa air dipisah

Campur sama Interphase

banyak dg pel. Organic
organik
e.g. phenol,
chloroform, or
phenol:chloroform

Hasil sentrifugasi dari Fas air mengandung DNA, fase Larutan DNA
ekstrak buffer lisis organik mengandung protein dan
supernatan :mengandung lemak, debris sel mengendap
DNA dan kontaminan
50
 3. Purifikasi dg Ekstraksi/Presipitasi
Tahap 2: Pengendapan DNA

Supernatant 70% EtOH

Centrifuge Wash Centrifuge

Pellet
+ alkohol dan garam Larut pelet (H2O,
(NaOAc &EDTA) untuk Buffer TE
mengendapkan DNA
• Pellet DNA
• Cuci dg etanol 70% untuk
menghilangkan garam dan
kontaminan lain
• Keringkan
Tahapan kromatografi adsorpsi

DNA dan kontaminan akan

berikatan dengan silika

Silika dicuci untuk

menghilangkan kontaminan

Silika dielusi untuk

mendapatkan DNA
53
54
55
56
Bahan dan alat

57
• Tahap setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil
pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil
ligasi molekul-molekul DNA tersebut menggunakan teknik
elektroforesis
• Jika hasil elektroforesis menunjukkan fragmen-fragmen DNA
genomik terligasi dengan baik pada DNA vektor sehingga
terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi
dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak
dengan cepat sehingga di dalam campuran reaksi tersebut
selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah
fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi
satu sama lain
• Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang
ini dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan akan
mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki
molekul DNA rekombinan.
58
Penentuan kualitas dan kuantitas DNA

Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta

UNAND
 Nucleic Acid Analysis via UV Spectrophotometry

DNA Absorption Spectra

• DNA mempunyai puncak absorpsi pada panjang

gelombang 260nm.
• Absorban 1,0 pada 260 nm sebanding dg 50 µg DNA/ml
 Kemurnian DNA

Perbandingan A260/A280 ratio is ~1.8 DNA murni

Kurang dari1,8 terkontaminasi

 Elektroforesis Untuk Visualisasi DNA
• Hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta hasil
ligasi molekul-molekul DNA dianalisis menggunakan teknik
elektroforesis
• Elektroforesis: Perpindahan DNA bermuatan negatif terhadap
medium agarosa atau polakrilamid sebagai aksi dari arus listrik
• Komponen:
• 0.8-1% gel agarosa untuk mencek genom, 1,5-2% untuk
fragmen DNA berukuran 200bp, 40% poliakrilamid untuk 1-300
pb
• buffer (TAE= Tris-Borat-EDTA;TBE=Tris-Acetat-EDTA; TPE=Tris-
Fosfat-EDTA)
• Loading dye (sukrosa/gliserol dan bromofenol biru)
• dan sampel DNA
Elektroforesis Untuk Visualisasi DNA
64
Dr. Jumsu Trisno; Jur HPT Faperta
UNAND
Elektroforesis Gel Agarosa
68
DNA dapat masuk ke dalam sel bakteri melalui
3 cara:
Metode memindahkan DNA rekombinan ke sel target

1. Transformasi : proses memasukkan DNA dari luar ke

dalam sel yang menyebabkan perubahan
(transformasi) pada sifat-sifat genetik sel inang
2. Konjugasi : perpindahan DNA dari satu sel (sel donor)
ke dalam sel bakteri lainnya (sel resipien) melalui
kontak fisik antara kedua sel
3. Transduksi : pemindahan DNA dari satu sel ke dalam
sel lainnya melalui perantara fage

71
 Transformasi
• Transformasi genetik adalah proses introduksi gen
dari satu organisme ke organisme lain yang
memungkinkan untuk memunculkan sifat harapan
tanpa mengubah sifat lain
• Sel inang dibuat kompeten (siap menerima “DNA
asing”)  modifikasi struktur dinding sel
• Metode transformasi :
1. Teknik induksi kompetensi sel secara kimiawi diikuti
dengan kejutan panas (heatshock) atau
2. Teknik elektroporasi

72
 Teknik transformasi sel tumbuhan

1. Infeksi sel tumbuhan dengan patogen tertentu,

misalnya bakteri Agrobacterium tumefaciens atau
virus tumbuhan tertentu
2. Pemasukan DNA secara langsung menggunakan alat
biolistik gen bombardment
3. Transformasi langsung dengan induksi kimiawi
menggunakan senyawa polietil glikol (PEG)
4. Fusi protoplas
5. Mikroinjeksi

73
Penggunaan plasmid Ti untuk
transformasi sel tumbuhan

74
 Penggunaan plasmid Ti untuk
transformasi sel tumbuhan
Gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam sel tanaman dengan cara menitipkannya
(menyisipkan) pada T-DNA. Agrobacterium yang digunakan untuk menginfeksi sel
tanaman adalah Agrobacterium yang sudah tidak patogen

75
Seleksi Transforman

76
77
78
Terima Kasih

79