Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi
(KCKT)
 Pendahuluan

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut

dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan
fasa diam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga
fasa geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat ke dalam
kolom dengan bantuan pompa/tekanan.
 Prinsip Kerja HPLC
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya
adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.

Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk

sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
1. Gradien Controller/Solvent Reservoir :
Fungsinya untuk menampung fasa gerak yang akan dialirkan ke dalam kolom dengan bantuan pompa. Syarat fasa
gerak yang digunakan harus dimilipore (pori-pori +5 μm) dan didegass.
2. Pompa :
Fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk ke dalam kolom.
3. Sample Introductions/Injector :
Fungsinya sebagai tempat memasukkan cuplikan/sampel dengan bantuan syringe.
4. Kolom :
Merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di dalam kolomlah terjadi pemisahan komponen-komponen cuplikan.
5. Detektor :
Fungsinya untuk mendeteksi komponen-komponen cuplikan hasil pemisahan kolom.
6. Data Output :
Fungsinya untuk menampilkan hasil yang diperoleh.
 Kelebihan KCKT

• Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

• Mudah melaksanakannya
• Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
• Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis
• Resolusi yang baik
• Dapat digunakan bermacam-macam detektor
• Kolom dapat digunakan kembali
• Mudah melakukan "sample recovery"
 HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau
berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai
berikut:

– Kromatografi Adsorbsi
– Kromatografi Fase terikat (Kromatografi Partisi)
– Kromatografi Penukar ion
– Kromatografi Pasangan ion
– Kromatografi Eksklusi Ukuran
– Kromatografi Afinitas
 Jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan:

– Fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya).
Fase diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang
dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah
heksana atau i-propileter.
– Fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya).
Fase gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.
 Persyaratan Fase Gerak HPLC:

– Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.
– Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu
interpretasi kromatografi.
– Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
– Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
– Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).
– Sesuai dengan detector.
 Wadah fase gerak (Reservoir)
– Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert).
– Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.
– Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.
– Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak.
– Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat
komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya
polaritas pelarut.
 Pompa HPLC
– Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana
syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
– Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam.
– Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.
– Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 20 mL/menit.
 Tiga jenis pompa yang digunakan dalam
HPLC:
– Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-
maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.
– Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang
digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada
tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.
– Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa.
Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan
alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.
 Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan dimasukkan ke dalam
kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume injeksi sangat tepat
karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume (misalnya 20 – 500 μL).
 Tipe Dasar Injektor
– Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan
lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
– Septum: Septum yang digunakan pada HPLC sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini
dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-
pelarut Kromatografi Cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan
penyumbatan.
– Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan
dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat
diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom.
Syarat- syarat injektor yang baik :
– Dapat memasukkan sampel ke dalam kolom dalam bentuk sesempit mungkin
– Mudah digunakan
– Keberulangan tinggi
– Dapat bekerja walaupun ada tekanan balik
 Kolom
– Kolom konvensional
– Kolom mikrobor
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
– Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada
kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
– Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer
massa.
– Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika
jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional
dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
 Detektor
– Detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak
bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan
detektor spektrometri massa;
– Detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan
selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
 Karakteristik Detektor:

Dasar Jenis Maksimum Peka terhadap Sensitivitas suhu

Pendeteksian sensitifitas kecepatan alir
Absorbsi UV Spesifik 2 x 10-16 Tidak Rendah
Absorbsi IR Spesifik 10-6 Tidak Rendah
Flourometri Spesifik 10-11 Tidak Rendah
Indek bias Umum 1 x 10-7 Tidak + 10-4 0 C
Konduktometri Spesifik 10-8 Ya 2% 0C
Spektometri massa Umum 10-10 Tidak Tidak ada

elektrokimia Spesifik 10-12 Ya 1,5% 0C