Prosedur dan Aplikasi

PCR dalam Diagnostik

By
SITTI HADIJAH
A. PERALATAN , BAHAN DAN PROSEDUR YANG DIGUNAKAN
DALAM PROSES PCR

Sebelum melakukan prosedur amplifikasi DNA dengan teknik PCR,

diperlukan pengenalan peralatan dan bahan terlebih dahulu sesuai dengan
metode pengembangan PCR masing-masing.
Berikut ini akan disajikanpersiapan alat, bahan dan prosedur dalam
teknik PCR yang rutin digunakan yaitu teknik PCR standar atau
konvensional
 1. Peralatan
a. Biosafety Cabinet

Komponen utama biosafety cabinet HEPA (High

Efficiency Particulate Air) dan ULFA (Ultra Low
Penetration Air), merupakan jantung dari
Biosafety Cabinet terbuat dari filter tipe kering
berbentuk mikrofiber borosilikat lembaran tipis
seperti kertas.

Fungsinya menyaring debu, asap, bakteri, jelaga,

serbuk sari dan partikel radioaktif).
b. Mesin PCR (PCR Thermal cycler)
Mesin PCR merupakan suatu alat yang
dipergunakan untuk mengamplifikasi atau
menggandakan untaian basa-basa DNA yang
dibatasi oleh pasangan primer pengapitnya
melalui pengaturan suhu dan penggunaan
enzim tahan panas tinggi.
Dalam proses amplifikasi tersebut, mesin PCR
akan bekerja secara otomatis sesuai
permintaan pengaturan suhu untuk tahap
denaturasi, annealing maupun ektensi/
elongasi serta berapa siklus yang diperlukan
sampai dengan proses PCR selesai.
Gbr. Alat PCR
 c. Pipet Mikro
Pipet dimaksudkan alat untuk mengambil larutan dari suatu
tempat ke tempat lain dalam jumlah tertentu secara
akurat.
Alat ini diperlukan dalam teknik PCR untuk mengambil
larutan atau suspensi dengan ketepatan yang sangat
tinggi dan volume yang relatif kecil ( dalam μL).
Dalam pemakaian pipet mikro perlu diperhatikan kisaran
volume yang sesuai untuk pipet yang bersangkutan.
Angka yang tercantum di dalam pipet menunjukkan volume
maksimum yang dapat diambil pemilihan ukuran pipet
dan tips pipet mikro tergantung pada volume yang akan
diambil
 About the day

● Misalnya untuk mengambil volume 80 μL, kita

gunakan pipet mikro dengan kisaran 10- 100 μL.
Pengambilan bisa dengan pipet mikro yang
1000 μL, tetapi kurang akurat.
● Demikian pula dapat dilakukan dengan pipet
ukuran 0-10 μL, tetapi harus diulang beberapa
kali.
Today is... ● Hal tersebut dapat menyebabkan kesalahan
yang cukup besar karena dengan pengambilan
Monday berulang kali terdapat kesalahan setiap kali
pemipetan walaupun dengan kesalahan yang
9 november sangat kecil.
d. Tabung (tubes)

News 1 News 2 News 3

Tabung mikro (micro Dikenal berbagai
tubes) dipergunakan macam ukuran di antaranya
dalam berbagai proses di tabung, mulai ukuran 0,5 mL; 1,5
laboratorium molekuler ukuran kecil mL; 2,0 mL
termasuk proses PCR sampai besar,
dalam berbagai volume.
 2. Bahan (Reagensia) Yang Diperlukan
Dalam Proses PCR

a. Larutan buffer stock

100 mM Tris-HCl pH 8,3 (pada suhu 25⁰C); 500
mM KCl; 1,5 mM MgCl2; 0,1% (b/v) gelatin.
Untuk mempersiapkan arutan buffer harus
digunakan komponen-komponen yang steril.
 "Sesuatu akan
sangat berharga,
ketika sangat sulit
untuk didapatkan." "Hargai,
sebelum hilang."
b. Larutan dNTP
buatlah larutan dNTP yang
merupakan campuran keempat
Larutan dATP, dTTP, dCTP, deoksiribonukleotida trifosfat
sehingga masing-masing
dCTP dan dGTP masing- deoksinukleotida trifosfat
masing disiapkan mempunyai konsentrasi 0,2 mM.
dengan
konsentrasi 10 mM sebagai Sterilkan larutan dNTP dengan
menggunakan filter.
larutan stock Larutan deoksinukleotida trifosfat
tersebut harus disimpan di dalam
freezer bersuhu -20⁰C.
Larutan
dNTPmix
c. Larutan oligonukleotida primer
Sebelum digunakan untuk membuat larutan
stok primer, oligonukleotida yang
diperoleh dari hasil sintesis dengan DNA
synthesizer sebaiknya dimurnikan
terlebih dahulu dengan cara tertentu.

Pada saat ini sudah tersedia kit

komersial yang dapat digunakan untuk
memurnikan DNA.
d. Larutan enzim Taq DNA polymerase
● Enzim Taq DNA polymerasesebaiknya disiapkan menjelang
digunakan.
● Encerkan stok enzim dengan menggunakan larutan 1X buffer PCR
steril sehingga diperoleh konsentrasi 2,5 unit/μL. Sebelum digunakan,
enzim yang telah diencerkan tadi harus selalu diletakkan pada es.
● enzim ini merupakan salah satu komponen yang termasuk mahal,
enzimTaq DNA polymerase disiapkan seperlunya saja dan sisanya
disimpan kembali dalam freezer bersuhu - 20⁰C.
 3. Prosedur
Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, enzim
DNA polimerase yangthermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermal
cycler.
CARA KERJA
PCR mix solution, untuk keperluan 10 μL pereaksi, maka campurkan:
● Aquadest steril = 2 μL ; PCR mix = 5 μL ; Primer 1(10pmole) = 1 μL ; Primer 2
(10pmole) =
● 1 μL dan Sampel DNA = 1 μL.
Contoh PCR Program:
1. Hot start (denaturasi awal) 94 ⁰ C selama 2 menit
2. Siklus amplifikasi diulang 31 kali terdiri dari
a) Denaturasi 94 ⁰ C selama 60 detik
b) Annealing 58 ⁰ C selama 45 detik
c) Ekstensi 72⁰C selama 60 detik
3. Periode ekstensi pada suhu 72 ⁰ C selama 5 menit.
Catatan: bila primer diganti program PCR menyesuaikan
susunan primer dan panjang DNA produk amplifikasi yang
diinginkan
Thank’s