MIKROBIOLOGI

FARMASI II

RUSTINI

FAKULTAS FARMASI
UNAND

06/20/21 1
 1. Pewarnaan Bakteri
2. Uji Biokimia
3. Antiseptik, desinfektan
dan koefisien fenol
4. Uji efektivitas pengawet
5. Penetapan Vitamin secara
mikrobiologi

06/20/21 2
 IDENTIFIKASI BAKTERI

1. Pemeriksaan Mikroskopik,
Bentuk bakteri, pewarnaan
2. Pergerakan, Tts bergantung
3. Uji biokimia
4. PCR (Polymerase Chain
Reaction)

06/20/21 3
 PEWARNAAN BAKTERI
 Dikembangkan Erlich dan Robert Koch
 Yang berperan dinding sel dan membran

sitoplasma

PEWARNAAN BAKTERI HIDUP (LIVING STATE)

 Untuk melihat pergerakan bakteri

 Menggunakan zat warna yang tidak toksis

 Jarang dilakukan karena bakteri hidup sukar

menyerap warna
06/20/21 4
 PEWARNAAN BAKTERI
MATI (FIXED STATE)
 Intensifier, bahan kimia (fenol,
deterjen), fisika (panas)
 Mordant (memperkuat
ikatan zat warna dengan bakteri
 Zat peluntur warna (alkohol atau
aseton)
 Zat warna tanding (safranin)

06/20/21 5
 TEORI PEWARNAAN BAKTERI
Teori Fisika (Fisher)
 Proses absorbsi zat warna oleh
bakteri, tergantung pada kekuatan
absorbsi dari permukaan bakteri

Teori Kimia (Paul Ehrlich)

 Reaksi kimia antara zat warna
dengan bakteri, menghasilkan
komponen baru yang berbeda dengan
komponen pembentuknya
06/20/21 6
 JENIS PEWARNAAN
1. Pewarnaan negatif
- Bakteri tidak diwarnai, mewarnai latar
belakang
- Untuk bakteri yang sulit diwarnai

2. Pewarnaan sedehana
- Menggunakan satu macam zat warna
- Untuk melihat bentuk sel

3. Pewarnaan diferensial
- menggunakan lebih dari satu macam
zat warna (Gram dan Tahan Asam)

4. Pewarnaan khusus
- Untuk mewarnai struktur tertentu
bakteri (kapsul, spora, flagel dll)
06/20/21 7
 Pewarnaan Negatif
Untuk bakteri yang sulit diwarnai, mewarnai latar
belakang sel dengan zat warna asam (hitam nigrosin)

Prinsip

Memerlukan pewarna asam seperti eosin atau

nigrosin yang bermuatan negatif kromogen,tidak
akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel
karena permukaan bakteri juga bermuatan negatif.
Oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat
dengan latar belakang berwarna.

06/20/21 8
 PROSEDUR KERJA

06/20/21 9
 Pewarnaan Sederhana
Tujuan untuk melihat morfologi baakteri
dengan mempertinggi kontras antara sel
dan sekelilingnya.

Prinsip:
Zat warna dengan kromogen muatan positif
(bersifat alkalin), asam nukleat bakteri
serta komponen dinding sel bermuatan
negatif (bersifat basofil) menyerap dengan
kuat dan mengikat kation kromogen
Zat warna yang biasa digunakan : metilen
blue (30-60 dtk), karbol fukhsin (5 dtk) dan
kristal violet (10 dtk)

06/20/21 10
06/20/21 11
 PEWARNAAN DIFERENSIAL
PEWARNAAN TAHAN ASAM
 Bakteri tahan asam (acid fast) dan tidak
tahan asam (non acid fast)
 Bakteri tahan asam (karena zat warna

yang diberikan tidak luntur dengan

alkohol 96% dan asam kuat) dinding
selnya mengandung asam mikolat yang
menghambat penetrasi zat warna
06/20/21 12
 - Contoh : Mycobacterium tuberculosis, M.
leprae, Nocardia

Metoda

1. Ziehl_Neelsen, bakteri berwarna merah, latar

belakang berwarna biru

2. Kinyoun, bakteri berwarna merah, latar

belakang berwarna hijau

3. Mikroskop fluoresent, pewarna fluoresent

(auramine-rhodamin)
06/20/21 13
 A.  Non Acid-fast bacteria
B.  Acid-fast bacteria

06/20/21 14
 PROSEDUR ZIEHL NEELSEN
a smear
↓heat fix
Carbolfuchsin, 8-10min Primary Stain
↓wash
Acid Alcohol, 0.5-1min Decolorization

↓wash
Methylene Blue, 1min Counterstain
↓wash
Dry with paper
↓
Observation

06/20/21 15
 Acid-fast Non acid-fast

06/20/21 16
06/20/21 17
06/20/21 18
 PEWARNAAN GRAM
- Hans Christian Gram (1884)
- Gram positif (ungu), negatif (merah)

- Hanya dapat dilakukan pada bakteri yang

memiliki dinding sel karena yang berperan

adalah dinding selnya

06/20/21 19
 - Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal
langsung dari penderita, berupa sputum, pus
(nanah), discharge telinga, discharge hidung,
urin dan cairan serebrospinal.

 Spesimen yang akan diwarnai, dibuat sediaan

atau preparat (smear) terlebih dulu

06/20/21 20
 Bahan langsung dari penderita
 Bahan disentrifuge, kemudian endapannya
dibuat preparat, diambil dengan ose steril atau
kapas lidi steril kemudian digoreskan pada
gelas objek setipis mungkin

 Panaskan gelas objek di atas nyala api sampai

preparat tersebut kering

 Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu

selama 5 menit dan keringkan

 Setelah kering, preparat siap diwarnai

06/20/21 21
 Bahan dari biakan cair

 Ambil bakteri dari biakan cair (yang

sebelumnya telah diaduk secara steril) ratakan
pada gelas objek sehingga membentuk
diameter kira-kira 1-2 cm

 Preparat kemudian dikeringkan dan ditetesi

formalin dengan cara seperti pembuatan
preparat langsung.
06/20/21 22
 Bahan dari media pertumbuhan
padat

 Pada gelas objek teteskan satu ose kaldu atau NaCl,

letakkan bakteri, ratakan hingga membentuk
diameter 1 – 2 cm, campur dengan kaldu tadi
sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya
dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan
bahan berasal dari penderita.

06/20/21 23
 TEORI PEWARNAAN GRAM

Teori Salton

 Berdasarkan kadar lipid yang tinggi di dalam

dinding sel bakteri Gram negatif. Lipid akan
larut waktu pencucian dengan alkohol. Pori-
pori dinding sel membesar, sehingga zat
warna yang sudah diserap mudah dilepaskan
dan bakteri menjadi tidak berwarna.

06/20/21 24
 Bakteri Gram positif mengalami denaturasi
protein pada dinding selnya akibat pencucian
dengan alkohol. Protein menjadi keras dan
beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks
kristal yodium yang berwarna ungu
dipertahankan dan bakteri akan tetap
berwarna ungu.

06/20/21 25
 Teori permeabilitas dinding sel

Berdasarkan ketebalan lapisan peptidoglikan

dinding sel.

 Bakteri Gram positif mempunyai susunan

dinding sel yang kompak dengan lapisan
peptidoglikan 30 lapis. Permeabilitas
dinding sel kurang, kompleks kristal yodium
tidak dapat keluar
06/20/21 26
  Bakteri Gram negatif lapisan peptidoglikan
tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan
dinding selnya tidak kompak.
Permeabilitas dinding sel lebih besar
sehingga masih memungkinkan
terlepasnya kompleks kristal yodium

06/20/21 27
 Pewarnaan Gram memerlukan :

Warna utama (Kristal violet)

Mordant (larutan iodin)
Peluntur warna (etanol 95 %)
Warna tanding (safranin)

06/20/21 28
06/20/21 29
 PROSEDUR KERJA

Prepare a smear, air dry

↓flame 3 times to fix
Crystal violet, 1 min Primary stain
↓wash
Gram’s iodine, 1 min Mordant Stain
↓wash
Ethanol 95%, 0.5 min Decolorization
↓ wash
Safranin, 1 min Counterstain
↓
Dry slide with paper
↓
Observation
(10× lens →40× lens → oil-immersion lens )
06/20/21 30
Gram Staining Procedure
 Gram Negative Cocci Gram Negative Rods

06/20/21 32
 Gram Positive Cocci Gram Positive Rods

06/20/21 33
 PEWARNAAN KHUSUS

 Untuk melihat struktur tertentu

bakteri misalnya kapsul, spora, dan
flagel

 Pewarnaan Schaeffer Fulton

(Spora)

06/20/21 34
 PEWARNAAN SPORA
 Prinsip

Spora kuman mempunyai dinding yang tebal

sehingga diperlukan pemanasan agar pori-pori
membesar sehingga zat warna fuchsin dapat
masuk, dengan pencucian pori-pori kembali
mengecil menyebabkan zat warna fuchsin tidak
dapat dilepas walaupun dilunturkan dengan
asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri
warna fuchsin dilepaskan dan mengambil warna
biru dari methylen blue.
06/20/21 35
 Prosedur pewarnaan endospora dengan
metode Schaeffer-Fulton.

06/20/21 36
 Beberapa tipe endospora dan contohnya

06/20/21 37
 A.  Vegetative Cell
B.  Endospore

06/20/21 38
 PEWARNAAN KAPSUL
Cara Anthony, Hiss dan Muir atau pewarnaan
negatif menggunakan tinta cina

Prosedur Hiss :
Dibuat sediaan dan difiksasi
Di (+) kristal violet dan panaskan 1 menit
Dicuci dengan larutan CuSO4 20%
Dikeringkan, dilihat dibawah mikroskop
06/20/21 39
 PEWARNAAN FLAGEL
Prosedur :
1. Tambahkan 1 ml larutan pewarna flagel
(suspense koloid garam asam tanat yang
tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat
tebal pada dinding sel dan flagel ) pada
sampel, biarkan 10-15 menit. 
2. Genangi sampel dengan air mengalir dari
kran
3. Keringkan sampel dan genangi dengan
karbol fukhsin selama 1 menit. Keringkan di
udara. Jangan keringkan dengan kertas
hisap 

06/20/21 40
06/20/21 41
06/20/21 42