Protein

Recombinant into
Terapeutic Proteins
 Dikemas
Culture Purifikasi Formulasi Menjadi
Produk

Apa Kalian Tau Bahan Awal

Proses Produksi Erythropoietin?
 ME?

Chineese
Hamster

?
WCB CHO Cell
EPO GENE
 Fragmen DNA yang menyandi
pembentukan EPO (EPO Gene)
disisipkan pada plasmid bakteri.
Biasanya, ditambahkan pula gene yang
berfungsi sebagai marker (penanda)
terekspresinya gen yang disidipkan,
contohnya gen penyandi resisten
antibiotik, atau gen + DHFR.

Proses Kemudian bakteri ini dilakukan seleksi,

yang mengekspresikan protein target.

Penyisipan Setelah diseleksi, dilakukan perbanyakan

kultur tunggal pada bakteri yang telah
mengekspresikan gen target.
Gen Target Plasmid ini berfungsi sebagai carrier
host.
Rekombinasi Gen Target pada Plasmid ke Sel
Hewan
• Plasmid yang telah disisipi gen target tadi, dihilangkan dinding selnya
sehingga menjadi protoplast, kemudian disisipkan ke sel hewan melalui 3
cara:
• DNA & Calcium Phosphate Co-Precipitation
• Elektroporation (membuka dinding sel dengan listrik)
• Lipofection (Coating DNA dengan lipid agar dikenali oleh membran sel)

https://www.youtube.com/watch?v=noNJjOthtJ8
Ekspresi Gen dan Produksi Protein
• Protein yang dihasilkan dari sel rekombinan ini tidak digunakan untuk fungsi
internal dari sel tersebut, maka dari itu, setelah pembentukan protein, protein
akan dikeluarkan keluar sel (Sekresi Eksternal).
• Sehingga pada proses harvest, dilakukan pengumpulan protein yang telah
disekresikan oleh sel, tanpa membunuh sel tersebut, tanpa menggunakan
komponen dari sel tersebut.
• Sel CHO yang digunakan merupakan sel adherent yang menempel pada
substrate (Roller bottle/T-flask)
Sel CHO digunakan
sebagai inang (Sarana)
dalam produksi protein.
Bagaimana Cara Memastikan Bahwa Sel Tersebut
tidak terbawa/ masih bersisa didalam produk?
• Dilakukan Penyaringan saat sebelum dilakukan purifikasi.
• Terdapat purifikasi 7 tahap untuk memastikan keamanan dan kemurnian
produk.
• Dilakukan pengujian terhadap kontaminan dan derivat yang mungkin tersisa:
Host Cell Protein, Host Cell DNA, Endotoxin, Mycoplasma, Sterility, dll.
Lalu, kalau proses penyisipan gennya dilakukan di
plasmid bakteri, mengapa kita memakai sel hewan?

• Karena protein yang dihasilkan sel hewan lebih stabil. Ada mekanisme “Post
Translational Modification”
• Proteinnya dikeluarkan oleh sel ke luar dari sel tersebut “Sekresi
ekstraselluler” sehingga proses harvest dan purifikasinya mudah.
• Protein dari bakteri memiliki resiko untuk menimbulkan alergi kepada pasien
akibat protein sampingan ataupun bahkan endotoxin yang mungkin timbul
dari penggunaan bakteri.
• Plasmid yang disisipkan pada sel hewan tidak dapat berreplikasi, pada sel
hewan, dan akan hilang seiring dengan proses pembelahan sel pada sel
hewan.
Lalu, mengapa yang digunakan adalah Chinese
Hamster Ovary (CHO)?
• Ada 2 macam sel hewan yang biasa digunakan dalam proses produksi protein
rekombinan, yaitu CHO dan sel meyloma. Namun, sel inang yang paling
efektif dalam mengasilkan EPO adalah sel CHO.
• Study menunjukkan 44 virus yang patoghen pada manusia seperti HIV,
Invluenza, dll tidak dapat melakukan replikasi di sel CHO.
• Digunakan sel bagian ovary karena sifat totipotensi dari ovarium.