Analisis Obat dalam

Sampel Biologi
RUSTINI

1
Sampel biologis adalah sampel yang diambil dari sebagian
tubuh, berupa cairan (cairan serebrospinal, air mata, keringat,
ludah, urin dan empedu), berupa campuran (Plasma, Serum,
Darah dan feses), berupa padatan (Otak, ginjal dan hepar, paru,
otot dan tulang)
Matriks biologi adalah bahan-bahan lain diluar analit dalam
sampel biologi
Analit dapat berupa senyawa tunggal atau campuran berbagai
senyawa yang akan dianalisis

2
• Penetapan kadar obat di dalam tubuh paling banyak dilakukan pada
darah karena darah tempat yang dominan dilalui oleh obat. Selain
itu darah juga menjadi tempat yang paling cepat dicapai oleh obat.
• Urin merupakan cairan hayati yang biasanya digunakan dalam uji
fase farmakokinetik untuk mempelajari disposisi suatu obat dan
menentukan kadar suatu obat untuk obat-obatan yang dieksresikan
lewat urin, minimal 10% nya terdapat dalam urin dalam bentuk utuh
yang belum dimetabolisme.

3
Tujuan analisa senyawa aktif dalam sampel biologi :
1. Untuk mengetahui/menetapkan adanya atau jumlah senyawa
endogenik tertentu : kimia klinik untuk tujuan diagnosa (gula
darah, asam urat, Hb)
2. Untuk menetapkan adanya atau jumlah senyawa eksogen
(berasal dari luar tubuh) : analisis metabolit, doping,
keracunan, kesetaraan dan ketersediaan hayati suatu obat
3. Untuk memantau penggunaan obat baik dalam analisis
farmakodinamik, pemantauan kepatuhan pasien

4
• Farmakodinamik : mempelajari efek obat terhadap fisiologi dan biokimia
serta mekanisme kerja obat
• Farmakokinetik : ADME
• Supaya bisa diserap oleh tubuh obat harus diubah menjadi metabolit
aktifnya (Pro drug = Pra obat). Prodrug bersifat labil, tidak mempunyai
aktivitas farmakologis, tapi dalam tubuh akan diubah menjadi aktif.
Contoh: Bioavailabilitas parasetamol ditingkatkan oleh ester propacetamol
dan sumacetamol. Kemudian dengan atau tanpa biotransformasi obat
diekskresi dari dalam tubuh.
• Tempat absorbsi, distribusi dan eliminasi obat adalah darah, Artinya tanpa
darah, obat tidak dapat menyebar ke seluruh tubuh dan dikeluarkan dari
tubuh. Proses absorbsi ditunjukkan dengan peningkatan kadar obat dalam
darah dan adanya proses distribusi serta eliminasi ditunjukkan dnegan
pengurangan kadar obat dalam darah. Jadi, besarnya obat yang ada dalam
darah mencerminkan besarnya kadar obat di tempat absorbsi, distribusi,
dan eliminasi.

5
Masalah/Kendala dalam analisis senyawa aktif dalam sampel biologi
yaitu :
1. Kadar analit yang umumnya sangat rendah, oleh karena itu perlu
pemilihan metode yang paling sensitif
2. Dalam sampel biologi biasanya mengandung berbagai senyawa
endogen atau eksogen yang dapat mempengaruhi analisis. Oleh
karena itu perlu dilakukan pemisahan sebelum analisis

6
Transportasi dan Penyimpanan sampel
1. Semua spesimen (sampel biologi) yang akan dianalisis diberi label
yang berisi nama pasien, tanggal lahir, nomor, asal, jenis, tujuan
analisis, tanggal penerimaan, nama pemohon analisis, dll
2. Semua spesimen hendaknya disimpan pada suhu 4oC sebelum
analisis, dan setelah dilakukan analisis sampel hendaknya
disimpan selama 3-4 minggu pada suhu 4oC atau untuk beberapa
sampel dan kasus, disimpan pada -20oC

7
Wadah Sampel
1. Menggunakan disposible container untuk menghindari kemungkinan
kontaminasi
2. Sampel biologi cair, disimpan dalam wadah gelas yang di seal dengan bahan
yang inert. Tutup karet sebaiknya dihindari untuk mencegah kemungkinan
absorpsi atau kontaminasi
3. Wadah plastik digunakan untuk sampel solid, selama tidak ada kontak
dengan dinding wadah untuk mencegah absorpsi oleh dinding wadah
4. Sampel selanjutnya dikemas dalam kotak karton untuk melindungi sampel,
dan dibawa dalam tas berbahan polythen supaya tidak basah bila kehujanan
selama proses transportasi

8
Penanganan awal sampel biologis
1. Denaturasi Protein
Obat dalam sampel biologis berada bersama dengan senyawa lain
terutama protein, karena obat akan berikatan dengan protein plasma untuk
didistribusikan sehingga harus dilakukan pemisahan.
Pemisahan bisa dengan cara denaturasi protein dengan penambahan asam
misalnya TCA 10% (Trichloro acetic acid) atau dengan pemanasan pada
suhu tertentu.
Denaturasi protein bisa dilakukan dengan mengatur pH medium,
misalnya asetonitril. Plasma dicampur dengan asetonitril volume
sebanding, larutan dijenuhkan dengan Na bisulfat atau NaCl, protein akan
mengendap dan obat terpisah terdapat pada fase atas.
Bisa juga dengan enzim proteolitik, misalnya enzim subtilisin.

9
2. Ekstraksi pelarut untuk senyawa hidrofobik
Senyawa ini tidak suka air, sehingga perlu dipertimbangkan sifat
senyawa pengekstraksi. Apabila pelarut yang dipilih lebih dari satu,
maka harus dipilih kombinasi yang tepat sehingga dihasilkan
komposisi pelarut yang dapat mengekstraksi secara efektif dan
efisien. Pelarut sesedikit mungkin, tetapi dapat menghasilkan
senyawa terekstraksi sebanyak mungkin
3. Liofilisasi
Kestabilan senyawa kimia dipengaruhi oleh sifat fisikokimianya,
oleh karena itu diperlukan penanganan yang tepat sehingga tidak
terjadi kerusakan. Salah satu upayanya adalah dengan pembekuan
(liofilisasi)

10
4. Hidrolisis konjugat
Diperlukan bila senyawa yang akan dianalisis dalam bentuk
terkonjugasi dengan senyawa lain. Senyawa yang digunakan dapat
berupa enzim atau senyawa kimia lain, sangat tergantung kepada
jenis ikatan konjugasi dan proses pembentukannya.
5. Derivatisasi kimia sebagai pendahuluan ekstraksi.
Dilakukan jika senyawa sulit untuk diisolasi, tetapi akan lebih mudah
kalau berada dalam bentuk derivatnya.

11
Sampel Darah
Cara pengambilan darah (phlebotomy):
1. Tusukan vena (venipuncture), cara yang paling umum di
laboratorium, diambil pada vena median cubital, pada anterior
lengan (sisi dalam lipatan siku)
2. Tusukan kulit (skinpuncture)
3. Tusukan arteri atau nadi
Untuk mendapatkan sampel darah yang memenuhi syarat uji, maka
prosedur pengambilan sampel darah harus dilakukan dengan baik
mulai dari persiapan alat, pemilihan jenis antikoagulan, pemilihan
letak vena, teknik pengambilan sampel,

12
Cara pengambilan darah vena ;
• Cara manual dengan menggunakan alat suntik (syring)
• Cara vakum dengan menggunakan tabung vakum (vacutainer)
• Volume darah yang diambil untuk dewasa 5-15 ml, 1-5 ml untuk
anak-anak ,1-3 ml untuk bayi

13
Pengambilan Sampel Darah
• Diambil dari venipuncture
(vena)
• Alat : syringe / vacutainer
apparatus / kateter vena
• Volume sesuai kebutuhan
biasanya 5 – 15 mL
• Mula-mula bagian atas
lengan diikat  dioleskan
antiseptik pengambilan
sampel darah dengan hati-
hati
Yang tidak boleh diambil darahnya :
1. Darah edema
2. Hematoma
3. Daerah dimana darah sedang ditransfusikan
4. Daerah bekas luka
5. Daerah intravena lines (tempat infus)

16
Penanganan Sampel darah
Pengumpulan, penanganan, penyimpanan dan penandaan
sampel darah yang tepat akan meningkatkan hasil analisis
Sampel harus segera dianalisis atau disimpan dengan teknik
penyimpanan yang sesuai prosedur, semakin lama
serum/plasma bersentuhan dengan eritrosit, semakin besar
penurunan kadar obat

17
• Sampel darah jangan digojog karena bisa terjadi hemolisis
• Darah total yang dianalisis dapat berupa : darah total, serum,
plasma, fraksi bebas protein
• Jika obat yang akan dianalisis peka terhadap degradasi enzim,
maka segera didinginkan atau degradasi enzimnya

18
Ada 4 turunan sampel darah vena :
1. Darah total
2. Serum
3. Plasma
4. Fraksi bebas protein

19
Komposisi darah :
1. Plasma (Serum, Fibrinogen)
2. Unsur sesuler (sel), eritrosit, leukosit dan platelet
(trombosit)

20
Serum dan Plasma Darah
• Untuk mendapatkan serum : darah utuh didiamkan
± 20 menit , disentrifuge kemudian diambil
beningannya
• Untuk mendapatkan plasma : Darah utuh +
antikoagulan disentrifuge, diambil beningannya
• Penggunaan plasma untuk analisis lebih sering
dipakai karena jumlah obat lebih banyak (bebas &
terikat protein plasma)
Perbedaan Plasma dan Serum

Plasma diperoleh dengan menambahkan suatu pencegah

penjedalan ke dalam darah

Serum adalah plasma yang fibrinogennya telah dihilangkan

dengan proses penjedalan
Bila darah tidak diberi antikoagulan terjadilah penjedalan, bila
disentrifugasi, maka beningannya adalah serum

23
Analisis sampel plasma
Darah dikumpulkan dalam tabung yang berisi
antikoagulan
Antikoagulan :
1. Heparin (garam Na)
2. Kalium oksalat (1 mg K2C2O4/ ml darah)

24
Cara penyimpanan plasma dan serum yang baru disentrifugasi :
1. Pada suhu kamar, 6 jam, tidak terjadi perubahan metabolit atau
enzim
2. Pada suhu 40C, 24 jam, plasma dan serum dapat disimpan
tertutup, tanpa perubahan
3. Untuk penyimpanan dalam waktu yang lama, sampel dapat
dibekukan atau diliofilisasi (freeze drying)

25
PLASMA
• Darah terdiri atas plasma dan sel-sel darah (merah dan eritrosit),
leukosit sangat sedikit yaitu 0,2% dari jumlah eritrosit. Selain itu
juga ada trombosit yang berguna pada proses penggumpalan darah
• Zat yang terlarut dalam plasma antara lain protein, garam-garam
mineral, zat makanan, hormon dan antibodi.
• Protein yang paling banyak di dalam plasma 6 – 8%. Protein di
dalam plasma antara lain fibronogen, globulin dan albumin. Albumin
dan globulin protein yang paling banyak di dalam plasma yang
berfungsi sebagai zat yang menentukan tekanan osmotik. Fibrinogen
protein untuk penggumpalan darah.

26
SAMPEL URIN

Urin adalah cairan sisa yang dilepaskan oleh ginjal, yang

kemudian dikeluarkan dari tubuh melalui proses urinasi
Ekskresi urin diperlukan untuk membuang molekul-
molekul sisa dalam darah yang disaring ginjal dan untuk
menjaga kestabilan cairan darah
Ginjal adalah organ penting dalam pengaturan kadar cairan
tubuh, keseimbangan elektrolit dan pembuangan metabolit
sisa dan obat dari tubuh

27
Sampel Urine
• Untuk studi obat atau metabolitnya melalui
ginjal
• Mudah dilakukan & banyak
• lama dan selang waktu penampungan urin
sesuai dengan karakteristik obat yang akan
diuji
• Umumnya tidak mengandung lipid dan
protein, mudah diekstraksi menggunakan
pelarut organik.
Penanganan Sampel Urine
• wadah penampung urine harus inert dan bebas
dari bahan pengganggu analisis
• untuk menghindari kontaminasi mikroba urin
dapat disimpan dalam lemari pendingin
• untuk analisis biasanya diperlukan 10–15 ml
urine
• hasil penetapan obat dari urine memberi
informasi yang penting tentang timbunan obat
dalam tubuh
Cara Pengambilan Sampel Urin
• Urin sewaktu, urin dikeluarkan pada waktu yang tidak
ditentukan secara khusus
Tujuan untuk memeriksa volume, makroskopis (warna,
kejernihan urin) dan urin lengkap
• Urin pagi, urin yang pertama dikeluarkan di pagi hari
setelah bangun tidur
Tujuan untuk pemeriksaan sedimen, berat jenis, protein,
dan test kehamilan berdasarkan HCG (Human Chorionic
Gonadotropin)

32
• Urin postprandial, urin yang pertama kali dikeluarkan 1,5 –
3 jam setelah makan
Tujuan : untuk pemeriksaan glukosuria
• Urin 24 jam, urin yang dikumpulkan selama 24 jam dalam
botol besar yang bersih dan diberi bahan pengawet
Tujuan : menentukan kuantitas suatu zat dalam urin

33
Pengujian Umum :
1. Warna
2. Kejernihan
3. Bau
4. pH
5. Protein
6. Glukosa
7. Nitrit
8. Keton
9. Analisis mikroskopis (Kristal, sel darah merah atau
putih, bakteri, sel ragi atau parasit)

34
Data yang didapat pada analisa obat dalam urin :
1. T ½ obat
2. Kecepatan ekskresi
3. Kecepatan eliminasi
4. % obat yang dimetabolisme
5. % obat yang diekskresi

35
Sampel Feses
• Untuk studi metabolisme kesetimbangan massa, dan analisis obat
dan metabolitnya yang terlihat di empedu
• Mudah & banyak
• dalam analisis perlu diperhatikan homogenasi dari feses untuk
dianalisis selanjutnya
• Ditampung menggunakan aluminium foil
Contoh Pengujian :
1. Alergi atau peradangan di tubuh, untuk evaluasi terhadap
alergi protein susu pada bayi
2. Infeksi, karena bakteri, virus atau parasit yang menyerang
sistem pencernaan
3. Masalah pencernaan, seperti malabsorpsi tertentu seperti
gula, lemak, atau bahkan gizi lainnya
4. Pendarahan di dalam saluran gastrointestinal

37
 Sampel Saliva
• Orang normal mampu memproduksi
saliva lebih dari 2 L dalam sehari.
• Sebagai alternatif jika tidak
memungkinkan mengambil darah
• Mengandung obat dalam bentuk tidak
terionisasi & tidak terikat protein
• Treatment untuk analisis lebih mudah
dan sederhana.
Pengambilan Sampel Saliva
 Saliva merupakan sampel yang ideal karena pengambilannya
tidak invasif dengan syarat apabila kadar obat dalam saliva
menggambarkan kadar obat dalam darah
 Cairan serebrospinal juga dapat digunakan sebagai sampel,
utamanya untuk obat yang bekerja di CNS, karena kedekatan
fisiologis dengan organ target, yaitu otak
 Sampel hayati yang jarang dianalisis kandungan
obat/metabolitnya adalah empedu, keringat, air susu dan air
mata

40
 Untuk monitoring dan penetapan dosis theofilin, dilakukan
monitoring kadar obat dalam darah dengan sampel saliva
 Saliva : harus diketahui rasio kadar saliva/plasma
 Beberapa obat diketahui ratio kadar saliva/plasma konstan
 Jumlah obat yang diekskresikan ke saliva berhubungan
dengan derajad ionisasi dalam pH fisiologis dan protein-
binding
 Bentuk obat tak terionkan akan terdapat paling banyak

41
PERLAKUAN AWAL (PRE
TREATMENT)
1. Beberapa sampel biologi yang mengandung protein seperti
darah (plasma dan serum) perlu diperlakukan awal berupa
penghilangan protein (deproteinasi) dengan cara
pengendapan atau hidrolisis. Pengendapan dilakukan dengan
penambahan asam trikloroasetat, amonium tungstat atau
amonium sulfat. Hidrolisis dilakukan dalam suasana asam
2. Ekstraksi dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai.
Kadang-kadang digunakan juga kromatografi kolom cepat
atau mikrodialisis untuk isolasi senyawa aktifnya

42
3. Proses ‘clean up’ atau pemekatan dengan menggunakan
ekstraksi fase pada (solid phase extraction)
4. Pemekatan (penguapan) dan pelarutan dalam pelarut yang
sesuai untuk pengukuran/analisis

43
 DEPROTEINISASI
FRAKSI BEBAS PROTEIN
 Bagian darah yang tertinggal setelah komponen sel dan protein
plasma dihilangkan. Fraksi ini mengandung bahan yang tidak
terikat pada protein plasma (elektrolit, glukosa, dll)
 Pengukuran kadar obat dalam fraksi bebas protein berguna untuk
menentukan senyawa bebas dan yang terikat pada protein
 Fraksi ini didapat dengan cara ultrafiltrasi, yang membiarkan air
dan molekul kecil menerobos lewat penyaring, sedangkan
molekul besar (albumin dan globulin) tertahan.
 Metode yang paling umum digunakan untuk deproteinase adalah
pengendapan protein sebagai garam yang tidak larut
44
 Zat Pengendap
Anionik :
1. Pikrat
2. Molibdat
3. Tungstat
4. Sulfosalisilat
5. Metafosfat
6. Perklorat
7. Trikloroasetat

45
Kationik
Ion-ion logam seperti :
1. Seng
2. Merkuri
3. Kadmium
4. Uranium
5. Besi
6. Tembaga
7. Timbal
8. ZnSO4
9. ZnSO4/Ba(OH)2
46
 Titik Isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu dimana protein tidak
mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya
sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik
 Pada pH isoelektrik (pl), suatu protein sangat mudah diendapkan
karena pada saat itu muatan listriknya nol
 Protein akan mengalami perubahan muatan pada pH di atas dan di
bawah titik isoelektriknya
 Pada pH dibawah TI muatan positifnya lebih besar, sedangkan diatas
TI muatan negatifnya lebih besar.
 Perubahan muatan menyebabkan menurunnya daya tarik menarik
antara molekul protein sehingga molekul lebih mudah terurai.
 Semakin jauh perbedaannya dari TI maka kelarutan protein semakin
meningkat
47
Deproteinisasi dengan dehidrasi
Sejumlah
tertentu
air

Dihilangkan
dari protein

Protein akan
mengendap

Sentrifugasi

48
Deproteinisasi dengan cara dehidrasi

Solvent (Suhu rendah)

1. Asetonitril
2. Aseton
3. Metanol
4. Etanol
Menarik mantel air yang melingkupi molekul-molekul protein

49
 Salting Out : kebanyakan protein tidak larut dalam larutan
garam pekat dan mengendap atau didesak keluar dari
larutan dalam keadaan tidak berubah.
 Prinsip ini digunakan untuk memisahkan protein dari darah

50
Salting Out

Protein
pada titik
isoelektrik

+ garam (Na
sulfat, Na
sulfit)

Protein
mengendap

51
 Karakteristik cairan pelarut untuk mempersiapkan sampel
biologis untuk proses ekstraksi
Pelarut Manfaat Kekurangan
Aquadest Melarutkan relatif baik, tidak merusak jaringan, pH Derajat ionisasinya tinggi, tidak
mendekati 7 merusak enzim pengganggu
Asam Lemah (<0,5N) Melarutkan relatif baik, mampu mendenaturasi enzim, pH Tidak baik untuk senyawa yang sensitif
akhir <7, meminimalkan terjadinya busa terhadap asam
Asam kuat (> 0,5 N) Melarutkan dengan baik, denaturasi semua enzim dan Bisa terjadi agregasi, tidak sesuai untuk
protein, pH akhir < 4 senyawa yang sensitif asam, dapat
merusak jaringan
Basa lemah (< 0,5 N) Melarutkan relatif baik, mendenaturasi beberapa enzim Tidak sesuai untuk senyawa yang
pH akhir > 7 sensitif terhadap basa, dapat
mengakibatkan berbusa (foaming)
Basa Kuat (> 0,5 N) Melarutkan relatif baik, mendenaturasi semua enzim dan Bisa terjadi agregasi, tidak sesuai untuk
protein, pH akhir > 10 yang sensitif basa, dapat merusak
jaringan, mengakibatkan busa yang
lebih kuat

52
Alat yang digunakan dalam bioanalisis :
1. Tersedia dan terjangkau
2. Sesuai untuk sampel maupun senyawa yang dianalisis
3. Selalu dikalibrasi dengan baik
4. Alat terawat sehingga data yang dihasilkan reliable dan
data tidak hilang

53
Beberapa masalah dalam sampel biologis

 Pemisahan/isolasi analit : mudah tidaknya sampel dianalisis

sebanding dengan fluiditasnya
 Cairan serebrospinal paling mudah ditangani, sedang darah
utu dan jaringan organ paling sulit

54
Penyimpanan Sampel Biologi
 Untuk menghindari dekomposisi dan perubahan kimia lain. Bila
obat/metabolit sensitif terhadap esterase; pendinginan pada 60C dan
atau penambahan NaF pada sampel
 Apomorfin : peka terhadap oksidasi oleh O2 diudara
 Pendinginan pada 150C mencegah terbentuknya quinon sampai dengan
4 minggu, pendinginan selanjutnya tidak menjamin terjadinya
dekomposisi kecuali dengan penambahan asam askorbat
 Pendinganan/pembekuan : mempertahankan stabilitas L-Dopa sampai
16 hari

55
 Plasma dan serum memerlukan sentrifugasi dalam proses
perolehannya. Vacutainer tuber mengandung silikon yang memudahkan
memisahkan serum/plasma dari corpus culi
 Tabung plastik (Ependorf) biasanya mengandung ester ftalat sebagai
plasticizer dan ester fosfat dapat mengganggu analisis
 Antikoagulan bila diperlukan : sitrat, heparin, EDTA dll (selama tidak
terjadi interaksi dengan analit)
 Pembekuan/frozen segera setelah pengambilan sampel sering kali tidak
dimungkinkan, pendinginan sementara dengan es dianggap cukup
sebelum dipindah ke tempat penyimpanan dalam suhu beku

56
 Kontrol suhu penyimpanan : Klorazepat akan mengalami
dekarboksilasi menjadi nordiazepam yang dipengaruhi oleh suhu dan
pH
 Wadah penyimpanan : wadah gelas lebih baik disebabkan
kemungkinan berkurangnya analit dan adanya plasticiser bila dengan
plastik
 Nitrogliserin terabsorpsi oleh wadah plastik, ada beberapa obat yang
dapat terabsorpsi oleh wadah gelas, dapat diatasi dengan sililasi
 Plastik punya kelebihan tidak mudah pecah, dalam pengangkutan lebih
disukai
 Dalam banyak hal perlu verifikasi dengan spiked biological sample
untuk mengetahui pengaruh wadah dan penyimpanan

57
 Konsentrasi obat adalah elemen penting untuk menentukan
farmakokinetik suatu individu maupun populasi. Konsentrasi obat
diukur dalam sampel biologi seperti air susu, saliva, plasma dan urin.
 Sensitivitas, presisi dari metode analisis harus ada untuk pengukuran
secara langsung obat dalam matriks biologis. Untuk itu metode
penetapan kadar secara umum divalidasi sehingga informasi akurat
didapatkan untuk dimonitoring farmakokinetik dan klinik
 Obat dalam bentuk aktifnya harus berinteraksi dengan reseptor atau
tempat aksi atau sel target, dengan kadar yang cukup tinggi. Sebelum
mencapai reseptor, obat terlebih dahulu harus melalui proses
farmakokinetik

58
 Fasa farmakokinetik meliputi proses fase II dan III. Fase II adalah
proses absorpsi molekul obat yang menghasilkan ketersediaan biologis
obat, yaitu senyawa aktif dalam cairan darah yang akan didistribusikan
ke jaringan atau organ tubuh
 Fase III adalah fase yang melibatkan proses distribusi, metabolisme
dan ekskresi obat, yang menentukan kadar senyawa aktif pada
kompartemen tempat reseptor berada

59