Dasar-dasar

Rekayasa Genetika
Kelompok 6
Nia Khairiani
Elsa Linatha Siregar
Miftah Salsabila
Nabilah Habsyah Lubis
OUTLINE

● PENGERTIAN DAN MANFAAT

REKAYASA GENETIKA
● TAHAPAN KLONING GEN
● ENZIM RETRIKSI
● ELEKTROFORENSIS
● VEKTOR KLONING
● REAKSI POLIMER BERANTAI
● ANALISIS FRAGMEN DNA
 REAKSI POLIMERASI BERANTAI
Polymerase chain reaction (PCR) merupakan teknik yang sangat berguna dalam membuat
salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali)
untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis) atau dimodifikasi secara tertentu. Fragmen pelacak
yang diperlukan dalam seleksi rekombinan molekul DNA untai ganda yang urutan basanya harus
komplementer dengan sebagian urutan basa fragmen (gen) yang dilacak. Fragmen pelacak dibuat
secara in vitro menggunakan teknik PCR. Penggandaan berlangsung melalui reaksi polimerisasi
yang dilakukan berulang-ulang secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap reaksi
polimerisasi membutuhkan komponen-komponen yaitu untai DNA yang akan digunakan sebagai
cetakan (templat),molekul oligonukleotida untai tunggal.

Sumber :
o Susanto, Agus Hery. 2011. Genetika. Yogyakarta : Graha Ilmu
Hal : 265
 DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan
digandakan urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence). Penggandaan urutan target
pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul primer, yaitu oligonukleotida untai
tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya
penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun , pada
PCR enzim polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah
denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95°C). Salah satu enzim
DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase yang diisolasi dari bakteri 
termofilik Thermus aquaticus (Taq) dikembangkan pada tahun 1988.

Sumber :
o Susanto, Agus Hery. 2011. Genetika. Yogyakarta : Graha Ilmu
Hal : 265
 PCR terdiri atas tiga tahap :
1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi templat
2. Tahap penempelan atau annealing
3. Dan polimerisasi primer
Yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95°C , 50°C, dan 70°C. Pada tahap
denaturasi , pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal.
Pada tahap selanjutnya masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah
primer yang masing-masing menmpel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya , kedua primer
tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah
menempel pada untai DNA templat , primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya
. Dengan demikian , pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA
tempat awalnya berupa sepasang untai DNA. Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu
akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran rekasi berikutnya.

Sumber :
o Susanto, Agus Hery. 2011. Genetika. Yogyakarta : Graha Ilmu
Hal : 269
 Analisis fragmen DNA
Molekul DNA rekombinan yang memperlihatkan hasil positif dalam reaksi hibridisasi
dengan fragmen pelacak sangat diduga sebagai molekul yang membawa fragmen sisipan atau
bahkan gen yang diinginkan . Analisis dapat dilakukan dengan dua pendekatan , yaitu analisis
restriksi dan analisis pengurutan basa nukleotida (sekuensing).

Sumber :
o Susanto, Agus Hery. 2011. Genetika. Yogyakarta : Graha Ilmu
Hal : 269
 Teknik sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah teknik yang dikembangkan
oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977 atas dasar reaksi pemotongan basa
yang spesifik. Dewasa ini metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah sangat jarang
digunakan karena ada metode lain jauh lebih praktis, yaitu metode dideoksi yang
dikembangkan oleh A. Sanger dkk , pada tahun 1977 juga. Metode Sanger Pada dasarnya
memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen
klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan
adanya dNTP dan ketidak mampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP.
Dengan dasar pemikiran itu sekunsing DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan
pada empat reaksi yang terpisah . Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi
DNA dapat berlangsung.

Sumber :
o Susanto, Agus Hery. 2011. Genetika. Yogyakarta : Graha Ilmu
Hal : 269
 Metode degradasi kimia (chemical degradation method), yang biasanya dikenal
dengan metode Maxam-Gilbert, karena metode ini dikembangkan oleh Maxam dan
Gilbert pada tahun 1977. Sekuen molekul DNA untai ganda ditentukan dengan perlakuan
menggunakan bahan kimia yang memotong molekul pada posisi nukleotida tertentu.
Fragmen DNA yang akan disekuens dilabel salah satu ujungnya menggunakan fosfat
radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-
potong secara parsial menggunakan piperidin. Ikatan antara fosfat dan gula dipotong
dengan piperidin (modifikasi waktu pemotongan dan konsentrasi piperidin akan
menghasilkan potongan dengan berbagai ukuran). Basa dimodifikasi secara spesifik.

Sumber :
o Susanto, Agus Hery. 2011. Genetika. Yogyakarta : Graha Ilmu
Hal : 269
 Tabung ddATP menghasilkan dua fragmen Dengan
ukuran tiga dan tujuh basa: tabung ddCTP
. menghasilkan tiga fragmen dengan ukuran satu ,
dua,dan empat basa: tabung ddGTP menghasilkan
dua fragmen dengan ukuran lima dan sembilan
basa: tabung ddTTP menghasilakn dua fragmen
dengan ukuran enam dan delapan basa. Didepan
(arah 5‘) tiap fragmen ini sebenarnya terdapat
primer, yang berfungsi sebagai prekursor reaksi
polimerisasi sekaligus untuk kontrol hasil
sekunsing karena urutan basa primer telah
diketahui.

Sumber :
Gambar. Skema sekuensing DNA
o Susanto, Agus Hery. 2011. Genetika.
a) Reaksi polimerisasi dan terminasi Yogyakarta : Graha Ilmu
b) Elektroforesis untuk melihat ukuran fragmen Hal : 265
Metode degradasi kimia juga memiliki kelemahan lain karena menggunakan bahan kimia yang beracun
dan berbahaya bagi kesehatan peneliti yang menggunakan metode tersebut. Banyak perbedaan pada
kedua metode tersebut, yaitu pada metode terminasi rantai menggunakan sekuens DNA tunggal identik,
disintesis secara enzimatik pada rantai polinukleotida yang komplementer, terminasi rantai ini
menggunakan nukleotida yang spesifik, pemisahan molekul DNA tunggal biasanya menggunakan
elektroforesis gel poliakrilamid. Metode ini juga menggunakan primer yang ditempelkan pada posisi yang
sama pada setiap molekul dan menggunakan DNA polimerase serta keempat deoksi ribosa trifosfat
(dNTPs – dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) sebagai substrat. Dideoksinukleotida (ddNTP) juga digunakan
dalam metode ini, dimana ddNTP dalam jumlah yang lebih sedikit daripada dNTP. Berbeda dengan
metode terminasi rantai, metode degradasi kimia tidak popular digunakan. Metode degradasi kimia ini
menggunakan bahan kimia, sekuens untai ganda yang digunakan dalam metode ini, salah satu fragmen
DNA yang akan digunakan dilabeli dengan menggunakan radioaktif, tidak memerlukan primer dan DNA
polymerase dalam sekuens DNA.

Gambar. Prinsip Kerja Maxam - Gilbert Sumber : Snustad, D. Peter.2012. Principles of

genetics. e United States of America :WILEY
Hal. 379-380
Gambar. Sekuensing Maxam-Gilbert (Mathews & Holde, 1995)
 Metode degradasi kimia juga memiliki kelemahan lain karena menggunakan bahan kimia yang
beracun dan berbahaya bagi kesehatan peneliti yang menggunakan metode tersebut. Banyak
perbedaan pada kedua metode tersebut, yaitu pada metode terminasi rantai menggunakan
sekuens DNA tunggal identik, disintesis secara enzimatik pada rantai polinukleotida yang
komplementer, terminasi rantai ini menggunakan nukleotida yang spesifik, pemisahan molekul
DNA tunggal biasanya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid. Metode ini juga
menggunakan primer yang ditempelkan pada posisi yang sama pada setiap molekul dan
menggunakan DNA polimerase serta keempat deoksi ribosa trifosfat (dNTPs – dATP, dCTP,
dGTP dan dTTP) sebagai substrat. Dideoksinukleotida (ddNTP) juga digunakan dalam metode
ini, dimana ddNTP dalam jumlah yang lebih sedikit daripada dNTP. Berbeda dengan metode
terminasi rantai, metode degradasi kimia tidak popular digunakan. Metode degradasi kimia ini
menggunakan bahan kimia, sekuens untai ganda yang digunakan dalam metode ini, salah satu
fragmen DNA yang akan digunakan dilabeli dengan menggunakan radioaktif, tidak memerlukan
primer dan DNA polymerase dalam sekuens DNA.
Thankyou