FITRIA RAHMADANI NIATI

NIM 431419013
KELAS B PENDIDIKAN BIOLOGI
MATA KULIAH BIOTEKNOLOGI
 Teknologi Cloning
rekombinan gen
DNA

POKOK
BAHASAN

Prospek manfaat aplikasi

rekayasa genetika dalam Individu
berbagai bidang transgenik
kehidupan

2
1
Teknologi Rekombinan
DNA
 Dalam bioteknologi modern selalu melibatkan suatu teknik untuk memindahkan gen dari suatu
organisme ke organisme lain dengan tujuan tertentu. Teknik ini disebut rekayasa genetika/DNA,
manipulasi genetika/DNA, atau rekombinasi genetika/DNA. Pada awalnya, rekayasa genetika
dimanfaatkan dalam studi genetika (mempelajari struktur dan fungsi/mekanisme kerja gen). Namun,
dalam perkembangannya, rekayasa genetika bertujuan untuk memecahkan berbagai masalah biologi;
misalnya: terapi gen, perakitan tanaman unggul, perbaikan gizi masyarakat. Selain itu, tahapan kerja
dalam rekayasa genetika seperti pemotongan DNA dan amplifikasi DNA (PCR) dapat digunakan untuk
memecahkan masalah-masalah
kejahatan melalui sidik jari DNA dan diagnosis penyakit.
Dalam rekayasa genetika (Gambar 13) pada umumnya selalu melibatkan
serangkaian proses berikut ini:
1. Isolasi DNA dari sel
2. Pemotongan DNA (baik gen yang akan disisipkan maupun DNA dari
organisme yang akan disisipi)
3. Penyambungan/penggabungan kedua jenis DNA tersebut membentuk DNA
rekombinan
4. Introduksi DNA rekombinan ke dalam sel
5. Seleksi sel rekombinan

4
 Isolasi DNA

Isolasi DNA dilakukan terhadap DNA yang membawa gen yang akan disisipkan (gen
target) dan DNA yang akan digunakan sebagai pembawa (vektor). DNA yang umum digunakan sebagai
vektor adalah plasmid (DNA ekstrakromosomal dari bakteri), cosmid (DNA fage yang membentuk plasmid),
dan DNA fage. Salah satu plasmid yang biasa digunakan sebagai vektor rekombinan adalah pUC18/19.
Pada umumnya, vektor rekombinan harus mempunyai situs pengenalan enzim restriksi yang spesifik
sehingga DNA tersebut dapat dipotong dan disisipi dengan DNA target. Situs enzim restriksi tersebut
memotong suatu gen yang berfungsi sebagai penanda seleksi (selectable marker), misalnya: gen penyandi
ketahanan terhadap ampisilin. Pada beberapa vektor, beberapa situs enzim restriksi yang digunakan untuk
penyisipan DNA target terkumpul dalam suatu wilayah yang disebut MCS (Multiple Cloning Site) atau
polylinker

5
Pemotongan DNA

Pemotongan dan penyambungan molekul DNA dilakukan secara enzimatis. Pemotongan pita
DNA dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi yang bekerja sangat spesifik, mengenali
situs tertentu dalam rantai DNA (misalnya: EcoRI mengenali dan memotong situs GAATTC)
dan menghasilkan pola tertentu (Gambar 11 dan 12). Berikut ini merupakan contoh enzim
restriksi yang lain beserta situs
pemotongannya:

6
Penyambungan DNA

Penyambungan pita DNA dilakukan menggunakan enzim ligase, yaitu enzim yang
berperan dalam membentuk ikatan fosfodiester kembali antara dua molekul DNA pasca
pemotongan. Enzim ligase yang umum digunakan adalah T4 DNA ligase.

Penyambungan DNA

Introduksi DNA ke dalam sel (bakteri, jamur, hewan dan tumbuhan) sering disebut
transformasi, sedangkan introduksi DNA fage λ ke dalam sel bakteri sering disebut transduksi
atau transfeksi

7
 Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan
mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang
fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk
gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara
konvensional.

8
2
CLONING GEN
Ada beberapa langkah dasar dalam Kloning Gen yaitu sebagai berikut :
1. Suatu frakmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon diinsersikan pada molekul DNA
sirkular yang di sebut sektor untuk menghasilkan chimoera atau molekul DNA rekombiner.
2. Vektor bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk kedalam sel tuan rumah ( host ) yang
biasanya berupa bakteri, walaaupun sel-sel jenis lain dapat di gunakan.
3. Didalam sel host, vektor mengadakan replikasi menghasilkan banyak kopi atau turunan yang identik,
baik vektornya sendiri maupun gen yang dibawanya.
4. Ketika sel host membelah, kopi molekul DNA rekombinasi diwariskan pada progeni dan terjadi
replikasi vektor selanjutnya.
5. Setelah terjadi sejumlah besar pembelahan sel, maka dihasilkan koloni atau klonsel host yang
identik

Tiap-tiap sel dalam klon mengandung satu kopi atau lebih molekul DNA rekombinasi dengan demikian
dikatakan bahwa gen yang dibawa oleh molekul rekombinasi telah diklon.

10
 Tehnik-tehnik Kloning Gen
1. Pengklonan c DNA
Karena banyak protein yang bernilai komersil hanya terdapat dalam jumlah kecil dalam sel-sel
dan jaringan hewan, dan karena ekspresi gen flon itu sangat penting, maka banyak pekerjaan
komersial itu terpusat pada pengklonan c DNA dari mRNA-mRNA yang terdapat dalam jumlah sangat
kecil didalam sel. Pendekatan lain yang digunakan untuk memperoleh insulin manusia, adalah sintesis
kimia dari suatu gen.
Hampir setiap molekul mRNA eukariot pada ujung 3’-nya mempunyai rangkaian resedu
nukleotida adenin yang disebut ekor poli-A. Apapun fungsinya, poli-A itu memberikan jalan yang
mudah untuk mensintesis suatu untaian DNA yang komplementer terhadap mRNA-nya. JIKa rantai
rantai pendek dari oligo –dT dicampur dengan mRNA, rantai tersebut berhibridasiasi ke ekor poli-A
untuk memberikan suatu primer untuk aksinya enzim transfriptase balik. Enzim ini, yang disolasikan
dari virus-virus tumor RNA tertentu dapat menggunakan RNA sebagai cetakan untuk mensintesis
suatu untaian DNA. Hasil reaksinya adalah suatu hibrida RNA-DNA, untaian DNA yang baru itu
mempunyai lingkaran tusuk konde pada ujungnya, tampaknya sebagai hasil dari enzim “ memutari
sudut “ dan mulai mengkopi dirinya sendiri. Lingkaran tusuk konde itu mungkin merupakan suatu
artefak ( sesuatu yang buatan ) ‘in vitro’ tetapi ia memang memberikan suatu primer yang sangat
mudah untuk pembuatan untaian DNA yang kedua. cDNA ( DNA) berantaian ganda yang dihasilkan
mempunyai lingkaran tusuk konde yang utuh ini dapat dibelah oleh S1 nuklease, yaitu suatu nuklease
spesifik yang beruntaian tunggal.
11
Molekul cDNA yang beruntaian ganda yang diperoleh dengan cara tersebut, lalu disiapkan
untuk disisipkan kedalam pBR 322, dengan jalan pemberi ekor dengan terminal
transferase atau dengan menambahkan tempat-tempat enzim restriksi buatan pada ujung-
ujung cDNA-nya.
Tempat-tempat restriksi ini yang kita sebut ‘penyambung” ( “linker”) adalah
oligunekloitida-oligunekloitida dari 8 sampai 10 pasangan basa yang dibuat secara
kimia.Penyambung-penyambung itu ditambahkan pada cDNA beruntaian ganda dengan
menggunakan DNA ligase, lalu penyambung-penyambung itu digunting hingga terbuka
dengan enzim restriksi, dan cDNA-nya, yang sekarang mengandung ujung-ujung lekat
yang dihasilkan oleh enzim tadi, dimasukkan ke dalam pBR 322 yang telah di belah
dengan enzim yang sama. Kemudian plasmid rekombinan yang mengandung cDNA yang
di hasilkan itu, dimasukkan ke dalam strain “ E. coli “ yang sesuai dan dikembangbiakkan.

12
2. Gen pengklonan : DNA rekombinan

Bakteri merupakan mesin-mesin efesien untuk untuk menciptakan turunuan identik DNA bacterifogdalam jumlah. Begitu
masuk dalam sel imangnya. DNA fag tersebut berlipat ganda berkali-kali, turunan dikemas kedalam partikel-partikel berdaya
tulang, baru dilepas dari sel inangnya sehingga siap mengulangi daur infeksitersebut. Jika kita adapat menempelkan gen
eukariotik kepada molekul DNA fag seperti itu, maka dapat direflikasi dengan cara yang sama sekali lagi endonukliase restriksi
memungkinkan musliaht itu. Ekori adalah endonuklease resttriksi yang dihasilkan oleh “E. koli” . enzim ini membelah DNA
hanya ditempat yang meliputi rangkaiannya.
Setiap utusan pilihan ganda itu dipotong diantara buangin dan adenin. Setiap kali hal ini terjadi ujung-ujung belahan
filman ganda itu membaawa panjang tambahan emapt nukleotida. DNA yang berpasangan (berhelai tunggal), yang dinamai
ujung “lengket” karena mapu berpasangan basa dengan molekul DNA yang manapun mengandung ujung lengket pelengkap.
Gagasannya adalah
memperlakukan kedua DNA eukariotik dan DNA bakteriopag dengan endonuklease retriksi yang sama sehingga tercipta ujung-
ujung pelengkap pada masing-masing. Dalam keadan yang sesusai, secara bercampur molekul-molekul DNA eukariotik akan
menempel pada molekul-molekul DNA dengan ujung-ujung lengketnya masingmasing. Kemudian DNA ligase dapat dipakai
untuk mengaitkan secara kovalen molekul-molekul itu bersama. Beberapa dari hibrid atau molekul-molekul rekombinan ini
akan tetap berdaya infeksi pada inang bakteriofognya (ekoli) sebagaimana bakteriofog yang normal. Hal ini dapat dideteksi
dengan membiarkan ekoli terbuka bagi campuran molekul DNA rekombinan dan selanjutnya menabur selsel pada cawan fetri
berisi agar. Sel-sel bakteri itu mulai berkembang biak, membentuk selaput sel-sel dipermukaan agar. Akan tetapi, setiap sel
yang secara berhasil diinfeksi oelh molekul-moleku DNA rekombinan akan membentuk banyak turunan baru DNA rekombinan
tersebut sebelum dibunuh dan dilisis.

13
 3. Pengklonan Individu Kromosom
karena sekarang terdapat kemungkinan untuk menyortir kromosomkromosom manusia secara fisik kedalam klas-klas
ukurang yang terpisah dengan suatu prosedur yang dikenal sebagai sortasi sel yang teraktifasi fluoresens (FACS :
fluoresende-activa-ted celsorting). Maka terbukti kemungkinan untuk mengkon DNA dari individu kromosom. Misalnya,
mulai dengan suatu galur sel manusia dengan kariotip yang abnormal (empat kromosom X) terdapat kemungkinan
mensortir cukup banyak kromosom X manusia yang bebas dari autosom untuk dapat membuat suatu perpustakaan fag X
dari DNA kromosom X itu. Bersama-sama, pag-pag rekombinan dalam perpustakaan itu mempunyai sebagian besar, jika
tidak dapat dikatakan semua, DNA kromosom X.

4. Pengklonan Onkogen Manusia

sekarang ini 3 onkogen manusia yang diduga telah diklon dengan menggunakan teknik penyaringan alu dan teknik
banntuan tRNA. Sudah emapt laboratorium yangh berlainan yang cecara sendiri-sendiri telah mengklon gen-gen kangker
kandung kemih. Semua gen ini tampak sama (berukuran mendekati 5,4 kb), tetapi kesamaan ini mungkin mencerminkan
kenyataan, bahwa galur-galur sel yang dianggap berlainan ini mempunyai sumber yang sama. Gen neuroblastoma
sekarang juga telah diklon secara lengkap dengan menggunakan metode bantuan TRNA yang memperlihatkan gen
mendekati 13,5 kb mengklon gen kangker kolon (paru-paru) terbukti lebih sukar mencapai, karena ia teralu besar untuk
diklon dalam sepotong fag. 35 macam fag, yang masing-masing mengandung rangkaianrangkaian varsail yang tumpang
tindih, mula-mula diisolasi lalu dianalisis dengan menggunakan tehnik-tehnik penyaring Alu dan homologi pada rangkaian
gen ras virus sarcoma Kirsten, prosedur gen ini berkembang yang kemudian digunakan untuk menentukan struktur gen 45
kb.
14
 5. Pengklonan hewan
Klon-klon yang ditangani oleh para ahli biologi molekular, biasanya klon-klon dari bakteri atau organisme lain, sel-sel
dalam kultur jaringan dan akhir-akhir ini molekul-molekul DNA. Para ahli taman dan pemulia tanaman sebaiknya, secara
teratur menangani dan memproduksi organisme-organisme tinggat lebih tinggi yang diklon, tanaman-tanaman yang mereka
biakkan dengan pemangkasan, enten, pembelahan umbi dan rhizoma (akar rimang) dan sebagainya.
Tumbuhan tinggi memberi kemungkinan untuk reproduksi aseksual dan klon; untuk banyak spesies liar, pembiakan
aseksual lebih penting daripada pembiakan seksual. Sebaiknya hewan-hewan tingkat alami tidak bereproduksi secara
aseksual. Untuk mengklon seekor binatang perlu untuk mengambil nukleus dalam telur yang telah dibuahi, baik melalui
pembedahan, maupun menonaktifkannya secara total dengan radiasi dan menggantikannya dengan nukleus yang diambil dari
individu lain. Ini memerlukan transplankasi suatu nukleus utuh yang tidak rusak dan mampu untuk berkembang.

6. Pengklonan Hormon Pertumbuhan Manusia

Hormon pertumbuhan manusia (HGH= Human Growth Hormone) adalah suatu rantai polipeptida tunggal yang
mempunyai 191 asam amino dan diproduksi dalam kelenjar pituiteria (kelenjar pada infundibulum otak). Seperti insulin, ia
tidak terglirosilasi. Hormon pertumbuhan mengendalikan pertumbuhan tubuh kita ; tubuh kecil orang kerdil disebabkan karena
kekurangan hormon pertumbuhan.
Dengan menggunakan kombinasi dari sintesis kimia DNA dan sintesis enzimatik cDNA, telah diproduksi suatu rangkaian yang
mengkode asam-asam amino 1-14 telah disintesis secara kimia.Langsung di depan kodon pertama, ditambahkan suatu trio
(triplet) basa (ATG) yang menspesifikasi asam amino metionin.Bila permulaan dari gennya telah disintesis secara kimia untuk
menjamin permulaan yang tepat dari proteinnya, maka diperoleh suatu rangkaian DNA yang mengkode sisa dari rantai
polipeptida yaitu, residu asam amino 25-19,1 dengan membuat kopikopi cDNA dari preparat-preparat nRNa darii sel-sel
pituitaria manusia.

15
Tujuan Mengklon Gen
1. Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut
2. Menganalisis atau mengidentfikasi urutan basa nukleotida pengendali gen
tersebut
3. Mempelajari fungsi RNA / Protein / Enzim yang disandi gen tersebut
4. Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan
penyakit bawaan
5. Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu. Misalnya memproduksi insulin,
ketahanan terhadap hama, dll.

16
3
INDIVIDU
TRANSGENIK
 Transgenik adalah suatu organisme yang mengandung transgen melalui proses bioteknologi
(bukan proses pemuliaan tanaman), Transgen adalah gen asing yang ditambahkan kepada suatu
spesies. Suatu jasad yang memiliki sifat baru, yang sebelumnya tidak dimiliki oleh jenis jasad
tersebut, sebagai hasil penambahan gen yang berasal dari jasad lain. Juga disebut organisme
transgenik.
Teknik bioteknologi tanaman telah dimanfaatkan terutama untuk memberikan karakter baru
pada berbagai jenis tanaman. Teknologi rekayasa genetika tanaman memungkinkan pengintegrasian
gen-gen yang berasal dari organisme lain untuk perbaikan sifat tanaman. Salah satu contoh aplikasi
bioteknologi di bidang pertanian adalah mengembangkan tanaman transgenik yang memiliki sifat (1)
toleran terhadap zat kimia tertentu (tahan herbisida), (2) tahan terhadap hama dan penyakit tertentu,
(3) mempunyai sifat-sifat khusus (misalnya: tomat yang matangnya lama, padi yang memproduksi
beta- caroten dan vitamin A, kedelai dengan lemak tak jenuh rendah, strawberry yang rasanya manis,
kentang dan pisang yang berkhasiat obat), (4) dapat mengambil nitrogen sendiri dari udara (gen dari
bakteri pemfiksasi nitrogen disisipkan ke tanaman sehingga tanaman dapat memfiksasi nitrogen
udara sendiri), dan (5) dapat menyesuaikan diri terhadap lingkungan buruk (kekeringan, cuaca
dingin, dan tanah bergaram tinggi).

18
Tujuan Mikroba Transgenik
Tujuan memindahkan gen tersebut untuk mendapatkan organisme baru yang memiliki sifat dan
kualitas ketahanan terhadap mikroba pengganggu sehingga produksi atau hasil menjadi lebih baik.
Hasilnya saat ini sudah banyak jenis mikroba transgenik, misalnya dapat diinokulasikan pada
jaringan tanaman jagung, kentang, kacang, kedelai, dan kapas. Keunggulan dari mikroba
transgenic tersebut umumnya adalah tahan terhadap serangan hama.

19
4
 Prospek manfaat aplikasi
rekayasa genetika dalam
berbagai bidang kehidupan
1. Bidang Pertanian

Kontribusi genetika di bidang pertanian, khususnya pemuliaan tanaman dan ternak.

Persilangan-persilangan konvensional yang dilanjutkan dengan seleksi untuk merakit bibit unggul,
baik tanaman maupun ternak.
Dengan adanya genetika persilangan tersebut menjadi jauh lebih efisien. Selain itu, teknik-
teknik pemulian seperti mutasi, kultur jaringan, dan fusi protoplasma kemajuannya benayak dicapai
dengan pengetahuan genetika. Contoh lain dari perkembangan genetika di bidang pertanian adalah
cara baru dalam mengatasi serangga hama. Dengan cara perakitan tanaman tahan serangga hama
melalui teknik rekayasa genetik. Salah satu kendalam dalam produksi suatu komoditas tanaman di
negara yang beriklim tropis dan lembab adalah serangan hama. Pemulian dan perekayasa genetik
memiliki tujuan yang sama. Pemulia tanaman secara konvensional melakukan persilangan dan atau
seleksi. Sedangkan perekayasa genetik mengembangkan secara terus menerus, serta
memanfaatkan teknik isolasi dan transfer gen dari sifat yang diinginkan. Melalui rekayasa genetik
sudah dihasilkan tanaman transgenic yang memiliki sifat baru seperti ketahanan terhadap serangga
hama atau herbisida, serta peningkatan kualitas hasil.

21
2. Bidang Kesehatan

Salah satu kontribusi genetikadi bidang kesehatan adalah diagnosis dan perawatan penyakit
fenilketonurani (PKU). Penyakit ini merupakan penyakit menurun yang disebabkan oleh mutasi gen
pengatur katabolisme fenialanin sehingga timbunan kelebihan fenilalanin dalam aliran darah sebagai
derivat yang meracuni sistem syaraf pusat. Contoh lainnya proyek genom manusia yang dipelopori oleh
Amerika Serikat dengan menguraikan 100.000 gen manusia. Genom manusia dapat digunakan
memprediksi berbagai penyakit. Dengan ilmu kedokteran prediktid dapat diketahui kemungkinan
seseorang mengalami penyakit kanker dengan analisa terhadap kombinasi gen-gen yang dimiliki.

3. Bidang Hukum

Kasus-kasus pembunuhan, perkosaan, dan teror dapat menerapkan rekayasa genetika untuk
memastikan benar tidaknya tersangka sebagai pelaku. Jika tersangka masih hidup, pengujian dilakukan
dengan membandingkan DNA tersangan dengan DNA obyek yang tertinggal di tempat kejadia, seperti
rambut dan lainnya. Namun, jika tersangka mati dan tubuhnya hancur dengan cara mengambil DNA dari
bagian tubuh tersangka dan dicocokkan pola restruksinya dengan DNA kedua orang tua atau saudara.

22
 Daftar Pustaka

1. Kimbal, John W. 1989. Biologi . Edisi kelima cetakan kedua. Penerbit Erlangga. Jakarta
2. Muhammad, S.A. 1991. Pengantar Kloning Gena. Yayasan Esentia Medica Yogyakarta
3. Roberts, J.A. Fraser, Pambrey, Marcus E. 1995. Genetika Kedokteran. Suatu Pengantar.Edisi
kedelapan Cetakan Pertama Penerbit Buku kedokeran (EGC) Jakarta.
4. Watson, James D., Tooze, John, Kurtz, David T. 1988. DNA Rekombinan.
Penerbit Erlangga Jakarta

23
TERIMA KASIH