HPLC

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAHY

SYAH DAFA D.D

1C-D3(22) / 1831410011
PE N G E R T I A N

HPLC adalah teknik kromatografi dg alat yang berfungsi

mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam (p
artikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia
oleh suatu cairan) dengan memompa cairan (fase bergera
k) pada tekanan tinggi melalui kolom hingga 400 atm.
Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lain
nya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk m
endorong fasa gerak
SUSUNAN ALAT HPLC
 - B A G I A N H P L C
BAG I A N

1.  Pompa (motor penggerak fasa gerak)

Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan melalui injektor.
a. Syarat :
-Tekanan hingga 6000 psi (400 atm) .
-tahan korosi & tahan terhadap fasa gerak
-Control laju alir yang akurat , hingga 20 mL/menit
-Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
-Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
b. Jenis:
-Pompa reciprocating (torak) : aliran yang berdenyut dan teratur (konstan), ada peredam udara
vol kecil (35 –400 L), tekanan > 10.000 psi
-Pompa Displacement (semprit) : seperti siring, aliran konstan(teratur), tak terbatas, dan tak
berdenyut
-Pompa Pnematik : tekanan < 20.000 psi, aliran tidak teratur (konstan)
 - B A G I A N H P L C
BAG I A N

2.  Injector (Pemasukkan cuplikan)

tempat memasukkan cuplikan kedalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sedikit
mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. .
a. Syarat : tekanan tidak turun
b. Teknik :
-syringe/ septum : disuntikkan melalui septum, tahan hingga tekanan 1500 psi/ 70 atm, tidak tahan
dengan semua pelarut kromatografi cair, partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
-stop-flow : aliran pelarut dihentikan sementara. Teknik ini digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil.
-loop vaive (kran cuplikan) : cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume
yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).
 - B A G I A N H P L C
BAG I A N

3. Kolom
Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan
. kolom dan kondisi kerja yang tepat.
Kolom merupakan bagian yang sangat penting dari disebut cartridge. Biasanya terbuat dari
stainless steel.
a Fungsi :
-Menyaring kotoran
-Menjenuhkan fasa diam
b. Jenis :
-Kolom analitik : d= 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom
-Kolom pengaman/guard kolom / preparatif : d= >6 mm, p =25 -100 cm , dpt digunakan pada
temperatur lebih tinggi dari temperatur kamar.
 - B A G I A N H P L C
BAG I A N
4.      Detector
Digunakan untuk mendeteksi adanya komponen sampel (cuplikan) di dalam eluen kolom (analisis
kualitatif) dan menghitung jumlahnya (analisis kuantitatif).
a. Syarat :
-sangat peka (sensitifitasnya tinggi) .

-tidak banyak berderau (noise)

-kisar respons linier yang luas & waktu respon rendah
-memberi respons untuk semua tipe senyawa
-tidak merusak cuplikan
b. jenis :    
-UV/Vis untuk senyawa organik, biasanya 254 nm
-Retraktif indeks (RI) detector
-Konduktifitas penukar ion
-Elektrokimia detector
-Polarografi redoks
-Indeks bias
 - B A G I A N H P L C
BAG I A N

5. Komputer (PC) dan Printer

Komputer berisi software pengolahan data yang menampilkan grafik dari pembacaan absorbansi
.
sampel terhadap perubahan waktu. Grafik hasil pembacaan disebut kromatogram.
 S I P K E R J A H P L C
PR I N

1.sampel yang akan diuji diinjeksikan dg injector ke dalam kolom

2.Dari injector, memompa sampel ke kolom dengan tekanan tinggi. Kolom diisi dengan partikel
.
padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai fasa
diam.
3.Dari kolom sampel kemudian akan terurai dan terpisah berdasarkan partisi antara fasa diam dan
fasa gerak yang satu sama lain tidak bercampur yang menjadi senyawa-senyawa kimia (analit)
sesuai dengan perbedaan kepolaran afinitasnya
4.Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
5.selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan personal
computer (PC) yang terhubung dengan alat HPLC.
Add an image

PRINSIP KERJA HPLC

CONTOH KROMATOGRAM HPLC
 A S E H P L C
FASE – F
Fase gerak (eluen/pelarut)
a. Syarat :  
-Murni, tanpa cemaran, tidak kental untuk menghindari penyumbatan dalam kolom
-Tidak bereaksi dengan kemasan
-Sesuai dengan detector .
-Dapat melarutkan cuplikan
-Mempunyai viskositas rendah
-Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
-Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
b. Jenis :
- interaktif
- non interaktif
-kepolaran (berdasar polaritas senyawa)
a. Fase norrmal : Fasa gerak nonpolar & Fasa diam polar
b. Fasa Terbalik : Fasa gerak polar & Fasa diam nonpolar
 S E - F A S E H P L C
F A

Fase diam (zat padat)

Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus diperkecil. sehingga berupa larutan homogen yang
tidak terdapat endapan lagi dan bening. fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran
yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi lebih
baik dan efisien.
 A A N H P L C
KEGUN

•untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif
antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu
.
•banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
•Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan
dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
•Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan
kolom butiran berlapis zat berpori.
•Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
•Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
•Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
•untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
 A N H P L C
KELEBIH
•Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah yang
tinggi.
•Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
•Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan. kepekaan yang tinggi.
•Kolom dapat digunakan kembali.
•Waktu analisa cukup singkat (cepat).
•HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak
stabil.
•Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
•Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
•Lebih teliti dan mudah melaksanakannya sehingga tepat dan akurat
•Resolusinya baik
•Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas
 U R A N G A N H P L C
K E K

•Harganya cukup mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang

terbatas
• Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor..
• Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali
dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.
•Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu
•Hanya bisa digunakan untuk asam organic
•Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi.
TERIMA KASIH