HPLC

(HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY)
ATAU
KCKT
(KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI)
 Kelompok 4
1.FERISKIANA T.
2.HAYU NINDIKA R.P
3.FARIZ DANDI N.
4.WINDI WAHYUNINGTIAS
5.ZEHAN FIRDAUSI R.
6.SYAH DAFA D.D
 PENGERTIAN HPLC

HPLC adalah teknik kromatografi dg alat yang

berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase
diam (partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara
kimia oleh suatu cairan) dengan memompa cairan (fase
bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom hingga 400 atm.
Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk
mendorong fasa gerak
JENIS-JENIS HPLC BERDASARKAN SIFAT FASE DIAM (MEKANISME SORPSI SOLUT)

1. Kromatografi Adsorbsi
Pemisahan kromatografi adsorbsi menggunakan fase diam berupa
silika, gel dan alumina. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi
yang akan berinteraksi dengan solut.
2. Kromatografi fase terikat
fase diamnya = silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat.
Modifikasi silika adalah hidrokarbon non-polar (contoh : oktadesilsilan
(ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik)
fase gerak = campuran metanol dg air atau dengan larutan bufer.
3. Kromatografi penukar ion
fase diam = dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak
(contoh : polistiren resin )
Fase gerak = air  karena sifat ionisasinya
4. Kromatografi Pasangan ion
digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi
masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel
ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran / kromatografi permiasi gel
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan
berat molekul > 2000 dalton. Fase diam = silika atau polimer yang
bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara
partikel), atau berdifusi lewat fase diam
6. Kromatografi Afinitas
digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang
sangat kompleks
1.  Pompa (motor penggerak fasa gerak)
Pompa berfungsi untuk memompa baik eluen dan sampel yang disuntikan melalui
injektor.
a. Syarat :
-Tekanan hingga 6000 psi (400 atm)
-tahan korosi & tahan terhadap fasa gerak
-Control laju alir yang akurat , hingga 20 mL/menit
-Dapat menyalurkan fasa gerak pada rentang kecepatan dan tekanan lebar
-Dapat digunakan untuk melakukan elusi gradien
b. Jenis:
-Pompa reciprocating (torak) : aliran yang berdenyut dan teratur (konstan), ada
peredam udara vol kecil (35 –400 L), tekanan > 10.000 psi
-Pompa Displacement (semprit) : seperti siring, aliran konstan(teratur), tak terbatas,
dan tak berdenyut
-Pompa Pnematik : tekanan < 20.000 psi, aliran tidak teratur (konstan)
2.  Injector (Pemasukkan cuplikan)
tempat memasukkan cuplikan kedalam pangkal kolom (kepala kolom),
diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom.
a. Syarat : tekanan tidak turun
b. Teknik :
-syringe/ septum : disuntikkan melalui septum, tahan hingga tekanan 1500 psi/
70 atm, tidak tahan dengan semua pelarut kromatografi cair, partikel kecil dari
septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan
penyumbatan.
-stop-flow : aliran pelarut dihentikan sementara. Teknik ini digunakan karena
difusi di dalam cairan kecil.
-loop vaive (kran cuplikan) : cara automatis (dengan menggunakan adaptor
yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual).
3. Kolom
Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan
kondisi kerja yang tepat. Kolom merupakan bagian yang sangat penting
dari disebut cartridge. Biasanya terbuat dari stainless steel.
a Fungsi :
-Menyaring kotoran
-Menjenuhkan fasa diam
b. Jenis :
-Kolom analitik : d= 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis
material pengisi kolom
-Kolom pengaman/guard kolom / preparatif : d= >6 mm, p =25 -100 cm ,
dpt digunakan pada temperatur lebih tinggi dari temperatur kamar.
4.      Detector
Digunakan untuk mendeteksi adanya komponen sampel (cuplikan) di dalam eluen kolom (analisis
kualitatif) dan menghitung jumlahnya (analisis kuantitatif).
a. Syarat :
-sangat peka (sensitifitasnya tinggi)
-tidak banyak berderau (noise)
-kisar respons linier yang luas & waktu respon rendah
-memberi respons untuk semua tipe senyawa
-tidak merusak cuplikan
b. jenis :    
-UV/Vis untuk senyawa organik, biasanya 254 nm
-Retraktif indeks (RI) detector
-Konduktifitas penukar ion
-Elektrokimia detector
-Polarografi redoks
-Indeks bias
5. Komputer (PC) dan Printer
Komputer berisi software pengolahan data yang
menampilkan grafik dari pembacaan absorbansi sampel
terhadap perubahan waktu. Grafik hasil pembacaan
disebut kromatogram.
 FASA GERAK DAN FASA DIAM DALAM HPLC
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau fasa gerak adalah salah satu dari variabel yang
mempengaruhi pemisahan.
Banyak dari pengubahan tergantung dari sifat alami analit, fase diam, dan fase bergerak.
Waktu saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu karakteristik
yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan kecepatan linear memberikan lebih
sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan menghasilkan chromatogram.
Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-zat organik seperti methanol.
Fase gerak (eluen/pelarut)
a. Syarat :  
-Murni, tanpa cemaran, tidak kental untuk menghindari penyumbatan dalam kolom
-Tidak bereaksi dengan kemasan
-Sesuai dengan detector
-Dapat melarutkan cuplikan
-Mempunyai viskositas rendah
-Mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak beracun
-Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
b. Jenis :
- interaktif
- non interaktif
-kepolaran (berdasar polaritas senyawa)
a.Fase norrmal : Fasa gerak nonpolar & Fasa diam polar
b.Fasa Terbalik : Fasa gerak polar & Fasa diam nonpolar
Fase diam (zat padat)
Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus diperkecil sehingga
berupa larutan homogen yang tidak terdapat endapan lagi dan bening.
fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran yang lebih kecil
sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa
menjadi lebih baik dan efisien.
SKEMA ALAT HPLC
PRINSIP DASAR HPLC
pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya
PRINSIP KERJA DAN INSTRUMENTASI HPLC
prinsip kerja dari HPLC :
•sampel yang akan diuji diinjeksikan dg injector ke dalam kolom
•Dari injector, memompa sampel ke kolom dengan tekanan tinggi. Kolom
diisi dengan partikel padatan yang berukuran kecil dilapisi secara kimia
oleh suatu cairan yang berfungsi sebagai fasa diam.
•Dari kolom sampel kemudian akan terurai dan terpisah berdasarkan
partisi antara fasa diam dan fasa gerak yang satu sama lain tidak
bercampur yang menjadi senyawa-senyawa kimia (analit) sesuai dengan
perbedaan kepolaran afinitasnya
•Hasil pemisahan tersebut kemudian akan dideteksi oleh detector
•selanjutnya dicatat oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan
menggunakan personal computer (PC) yang terhubung dengan alat
HPLC.
 KEGUNAAN HPLC
• untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa
mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu
• banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
• Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar
dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
• Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
• Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-
SAX.
• Dapat memisahkan vitamin- vitamin yang larut dalam air.
• Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.
• untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.
 KELEBIHAN HPLC
• Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya memisah
yang tinggi.
• Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.
• Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.
• Kolom dapat digunakan kembali.
• Waktu analisa cukup singkat (cepat).
• HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
tidak stabil.
• Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.
• Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
• Lebih teliti dan mudah melaksanakannya sehingga tepat dan akurat
• Resolusinya baik
• Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas
 KEKURANGAN HPLC
• Harganya cukup mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup
penelitian yang terbatas
• Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
• Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam
dengan ukuran 5 dan 3 mikrometer sela-sela partikel lebih
mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus seringkali dicuci dan
kemurnian larutan harus dijaga.
• Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu
• Hanya bisa digunakan untuk asam organic
• Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut,
analit, dan gradien elusi.
TERIMA KASIH