Anda di halaman 1dari 37

Kelompok 7:

Kromatografi Cair •Novarani 20330707


•Rika Febrianti Nawawi 20330708
Kinerja Tinggi
•Juise Fennia Putri 20330710
(KCKT) •Nanda Nurhayati 20330711
•Zein Kussfirona Zalty 20330713
•Rheamanda Devina 20330716
Tujuan

Prinsip

Teori

Cara Kerja

Hasil & Pembahasan

Kesimpulan
Tujuan Penelitian

This Photo by Unknown Author is licensed under CC BY


Untuk mengetahui cara analisis
Tujuan Penelitian kuantitatif kandungan tannin
pada ekstrak kulit delima putih
menggunakan metode Folin-
Ciocalteu dan KCKT

Untuk mengetahui cara analisis


kuantitatif kandungan tannin
pada ekstrak kulit delima putih
Memisahkan atau mengisolasi sejumlah menggunakan metode KCKT
senyawa organic, anorganik, maupun
senyawa biologis, analisis ketidakmurnian
Untuk mendapatkan kadar
(impurities), analisis senyawa-senyawa tannin pada ekstrak kulit
yang tidak mudah menguap (non-volatile), delima putih
dan pemisahan senyawa-senyawa yang
strukturnya hampir sama
Prinsip Penelitian

This Photo by Unknown Author is licensed under CC BY


• KCKT merupakan jenis kromatografi kolom &
bekerja dengan prinsip sama.
• Prinsip utama  Adanya adsorbsi
(penempelan permukaan) dari solut (cairan
sampel) ke dalam larutan melalui fase diam
yang menyebabkan adanya pemisahan solut
dengan larutan. Tingkat adsorbsi tergantung
pada afinitas dari fase diam & fase gerak.
Prinsip Fase diam terdiri dari adsorben, seperti
silika.

Penelitian • Pada KCKT, campuran sampel/analit yang


terlarut dalam cairan larutan dipompa & akan
menjadi fase geraknya. Jadi, analit masuk ke
dalam fase gerak. Larutan fase gerak karena
dipompa, maka bergerak melewati fase diam
dengan tekanan yang tinggi. Fase diam
terdiri dari kolom atau disebut kolom KCKT.
Ketika sampel dilewatkan pada kolom, maka
akan berinteraksi dengan dua fase tersebut
(fase diam dan fase gerak).
• Prinsip KCKT  Pemisahan komponen analit
berdasarkan kepolaran, setiap campuran yang keluar
akan terdeteksi dgn detektor & direkam dalam
bentuk kromatogram. Jumlah peak menyatakan
jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan
konsentrasi komponen dalam campuran.
• Interaksi analit pada fase diam & fase gerak
menyebabkan pemisahan. Pemisahan ini didorong
oleh kekuatan interaksi dan kepolaran. Bila analit
lebih polar dia akan menempel ke fase yang lebih

Lanjutan… polar, bila fase diam lebih polar maka analit akan
banyak menempel di dase diam. Akhirnya akan
menciptakan pemisahan-pemisahan fase. Deteksi
menggunakan detektor (UV-VIS) akan mengenali
pemisahan analit ini setelah melewati kolom HPLC.
SIgnal akan dikonversi dan direkam oleh komputer
dan ditunjukkan menjadi kromatogram.
• Fase gerak  Campuran air, asetonitril & metanol.
Berbagai komponen campuran berinteraksi pada
berbagai tingkatan karena interaksi fase diam &
gerak.
Diagram Skematik Sistem
KCKT • Penampung solven  Menampung
solven sebagai fase gerak
• Pompa  Mendorong solven &
analit melewati kolom dengan
tekanan tinggi
• Valve injeksi  Tempat
memasukkan analit ke dalam KCKT
• Kolom  Sebagai fase diam,
berperan dalam pemisahan analit
• Detektor  Mendeteksi jumlah
analit dgn detektor UV Vis
• Unit pemroses data  Memproses
hasil deteksi analit, flow, tekanan &
lainnya utk disajikan dalam laporan
Teori Dasar

This Photo by Unknown Author is licensed under CC BY


Teori Dasar
KCKT
• KCKT  Metode kromatografi cair yang paling banyak digunakan dalam analisis senyawa karena kompatibel
untuk sebagian besar senyawa terutama senyawa campuran yang konsentrasinya kecil & tekanan uapnya
rendah (non-volatile)
• KCKT  Sistem pemisahan dengan kecepatan & efisiensi tinggi yang didukung oleh kemajuan dalam
teknologi kolom, system pompa tekanan tinggi & detector yang sensitive & beragam.
• KCKT  Mampu menganalisa berbagai cuplikan secara kualitatif & kuantitatif, baik komponen tunggal
maupun campuran.
• Fungsi KCKT  Pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis
ketidakmurnian (impurities), analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile) &
pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama.
• Penggunaan KCKT  Isolasi senyawa, pemisahan senyawa campuran & penetapan kadar senyawa-senyawa
tertentu, seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat & protein-protein dalam cairan fisiologis,
menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat & lain-lain.
Lanjutan…
• Instrumen KCKT terdiri atas 8 komponen pokok, yaitu
1. Wadah fase gerak
2. Sistem penghantaran fase gerak
3. Alat untuk memasukkan sampel
4. Kolom
5. Detektor
6. Wadah penampung buangan fase gerak
7. Tabung penghubung
8. Komputer atau perekam

• Teknik KCKT digolongkan menjadi 2 jenis berdasarkan pola kepolaran fase diam & fase geraknya, yaitu fase normal & fase
terbalik
• Fase diam pada kromatografi fase normal memiliki sifat polar, polaritas pelarut ↑, kemampuan elusi ↑ . Sementara, fase
geraknya bersifat non-polar, polaritas pelarut ↑, kemampuan elusi ↓. Sebaliknya, pada kromatografi fase terbalik, fase
diamnya bersifat non-polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar.
• Kromatografi fase terbalik merupakan pilihan utama untuk kebanyakan sampel
• Metode KCKT  Metode analisis yang memiliki waktu analisis relative pendek untuk analisis secara rutin, menghasilkan
puncak yang sempit untuk rasio signal to noise yang besar & meminimalkan penggunaan fase gerak
Lanjutan…
• Tahap Pengembangan Metode KCKT, yaitu
1. Pengumpulan informasi tentang sampel yang akan dianalisis meliputi jumlah senyawa yang terdapat dalam
sampel, struktur kimia, berat molekul, pKa, spectra UV & kelarutan sampel.
2. Penentuan tujuan pemisahan dengan KCKT
3. Sampel untuk analisis KCKT ada beberapa jenis, yaitu larutan yang siap diinjeksikan pada system KCKT,
sampel padat yang perlu dilarutkan atau di ekstraksi & sampel pada yang perlu di pre-treatment terlebih
dahulu.
4. Detektor UV merupakan pilihan utama karena dapat diaplikasikan untuk kebanyakan sampel yang memiliki
kromofor. Oleh karena itu, informasi tentang spectra UV penting dalam pengembangan metode.
5. Bila respon UV senyawa tidak cukup kuat, maka dapat digunakan detector lain, misal detector fluoresen &
elektrokimia.
6. Pemilihan metode KCKT berdasarkan pada sifat analit
7. Sampel KCKT dapat berupa senyawa ion & netral. Bila sampel senyawa netral, fase gerak tidak perlu ditambah
dengan buffer, sedangkan senyawa asam atau basa biasanya memerlukan buffer.
8. Pemilihan system KCKT meliputi pemilihan system elusi, yaitu isokratik atau gradien
Lanjutan…
• Kondisi isokratik sering digunakan pada KCKT karena dapat memperkecil masalah operasi
• Senyawa yang sangat polar & mudah larut dalam air paling cocok dipisahkan dengan kolom fase terbalik
• Tanin bersifat polar & mudah larut dalam air, sehingga digunakan KCKT system fase terbalik dan elusi dengan system
isokratik.
• Analisis kuantitatif tannin dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik,
yaitu dengan fase diam C-18 & fase gerak asam fosfat 0,55%. Detektor yang digunakan merupakan detector UV
277nm dengan Panjang gelombang yang berdasarkan hasil scanning
Cara Kerja

This Photo by Unknown Author is licensed under CC BY


Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Tanin Ekstrak Kuli Buah Delima Putih ( Punica granatum L.) Menggunakan
Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

1. Preparasi Sampel
• Alat yang Digunakan Dalam Penelitian :
Alat-alat gelas yang lazim digunakan, batang pengaduk, cawan petri, freezer, kertas saring, kompor listrik, labu
erlenmeyer, mikropipet ukuran 100-1000 µL dan 10-1000µL , tabung reaksi, saringan (corong buchner), sentrifuge,
sonikator, spektrofotometer, detektor UV-Vis, syringe membrane filter 0,22 µm, system alat KCKT, kolom fase
diam KCKT, timbangan digital, vacum rotary evaporator, dan water bath.

• Bahan yang Digunakan Dalam Penelitian :


Kulit kering buah delima putih yang sudah dideterminasi, asam fosfat 85%, aquabidest, etanol 70% grade
teknis, follin, methanol gradient grade for liquid chromatograpy, natrium karbonat, tanin.

• Prosedur Uji Kualitatif Tanin dengan larutan Folin-Ciocaltea


Disiapkan 2 tabung reaksi bersih. Tabung pertama dimasukkan 300 µL larutan standar tanin kadar 1000 µg/mL
dan tabung reaksi kedua diisi 300 µg/mL sampel 1000 µg/mL. tambahkan pada masing-masing tabung 1,5 mL larutan
folin. Gojog dan diamkan selama 3 menit. Kemudian ditambahkan kembali masing-masing tabung 1,2 mL larutan
Na2CO3. gojog dan didiamkan. Positif tanin jika terbentuk warna biru.
Lanjutan…
 Preparasi Sampel Kuli Buah Delima Putih Kering :
1. Kulit buah delima putih dicuci bersih kemudian dibelah
2. Diambil kulit buah lalu dikeringanginkan selama 1 minggu di bawah sinar matahari dengan ditutupi kain hitam
3. Setelah kering, kulit delima diblender hingga menjadi serbuk

 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Delima Putih :


Pembuatan ekstrak dilakukan dengan cara maserasi yaitu dengan merendam serbuk simplisia buah delima sebanyak
150 gram dan 750 ml etanol 70% ke dalam bejana kaca dan diaduk hingga homogen. Proses maserasi ini dilakukan selama
5 hari dan digojok setiap pagi, siang, sore. Hari ke-5 dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring sehingga terjadi
keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar dan di dalam sel. Selanjutnya ampas dan filtrat jernih dipisahkan.
Ampas ini dimaserasi kembali dengan penyari selama 24 jam. Kemudian filtrat hasil remaserasi diuapkan pada
evaporator pada suhu 50ºC hingga diperoleh ekstrak yang kental.
2. Preparasi
Larutan Standar
 Pembuatan larutan baku standar tanin :
1. Standar tanin ditimbang seksama 10,0 mg
2, Dimasukkan dalam labu takar 10 ml
3. Dilarutkan dalam aquabidest hingga tanda tera (1000 µg/mL)
4. Larutan tersebut disonikasi selama 15 menit dan disaring dengan membran filter 0,22 µm
5. Diperoleh konsentrasi larutan baku standar tanin 1000 µg/mL
3. Scanning λmax
 Penentuan panjang gelombang pengukuran baku standar tanin :
Penentuan panjang gelombang baku standar tanin dibuat menggunakan spektrofotometer UV antara
panjang gelombang 200-400 nm. Diambil sebagian larutan baku standar tanin dan dimasukkan ke dalam
kuvet lalu dilakukan scanning dengan spekktrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 200-400 nm,
sehingga diperoleh spektrum serapan dan panjang gelombang maksimum tanin. Nilai panjang gelombang
maksimum yang diperoleh diset sebagai panjang gelombang deteksi pada sistem KCKT.
4. Kurva Kalibrasi
 Analisis Kura Baku dan Sampekldengan KCKT
Sejumlah 20 µL larutan kurva baku dan sampel diinjeksikan dalam alat KCKT. Larutan
kemudian dibawa masuk ke dalam kolom oleh aliran fase gerak yang dialirkan dengan tekanan
dari pompa. Di kolom inilah larutan dianalisis kadarnya.
Running larutan kurva baku dan sampel dilakukan selama 10 menit dengan panjang
gelombang hasil scanning. Dari analisi ini didapatkan data berupa kromatogram yang
menggambarkan luas area kurva baku. Selanjutnya data tersebut diolah dengan metode regresi
linier.
5. Penetapan Kadar
Kulit Buah Delima
1. Sebanyak 10,0 mg sampel ekstrak ditimbang seksama dan dilarutkan dalam 10 mL aquabidest
2. Larutan tersebut disonikasi selama 15 menit dan disaring dengan membran filter 0,22 µm.
3. Diperoleh konsentrasi larutan baku standar tanin 1000 µg/mL.
4. Dipipet 200 µL larutan sampel tersebut menggunakan mikropipet kemudian ditambahkan
aquabidest.
5. Homogenisasi larutan tersebut menggunakan vortex selama 20 detik dengan kecepatan 40
rpm.
6. Sampel disuntikkan sebanyak 20 µL ke sistem KCKT, kemudian dicatat luas puncaknya.
7. Percobaan direplikasi sebanyak 3 kali.
8. Kadar tanin dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear yang diperoleh dari
kurva kalibrasi.
Hasil & Pembahasan

This Photo by Unknown Author is licensed under CC BY


Hasil
1. Ekstraksi
 Hasil penguapan diperoleh ekstrak etanol sebesar 95,415 gram sehingga diperoleh rendaman
ekstrak etanolik sebesar 63,31 % dalam kulit buah delima kering

2. Analisis Kandungan Tanin


(Folin-Ciocalteu)
 Setelah filtrat ditetesi dengan larutan folin dan natrium bikarbonat, terjadi perubahan
warna filtrat yaang semula berwarna kuning kecoklatan menjadi warna biru. Hal ini, dapat
disimpulkan bahwa di dalam filtrat terdapat tanin.
3. Analisis Kualitatif
Kandungan Tanin (KCKT)
 Analisis kualitatif kandungan tanin dengan
KCKT diperoleh waktu retensi standar tanin
16,518 menit. Dengan waktu retensi yang
sama antara standar dan sampel.
3. Analisis Kuantitatif
Kandungan Tanin (KCKT)
a) Penentuan Panjang Gelombang
Pengukuran Baku Standar Tanin
 Dari hasil pembacaan absorbansi,
didapatkan panjang gelombang
maksimum adalah 277,4 nm. Panjang
gelombang ini digunakan untuk
menganalisis kadar dengan KCKT.
3. Analisis Kuantitatif
Kandungan Tanin (KCKT)
b) Optimasi Sistem KCKT
 Hasil optimasi sistem dalam analisis
senyawa tanin diperoleh waktu retensi
16,518 menit.
3. Analisis Kuantitatif
Kandungan Tanin (KCKT)

c) Pembuatan LBS Tanin


 Larutan standar tanin dibuat dengan melarutkan standar tanin dengan aquabidest dan
disonikator selama 15 menit, lalu disaring dengan membrane filter 0,22 µm. Hasil
pembuatan larutan standar tanin mendapatkan hasil yang larut dan siap digunakan untuk
analisis ke dalamsistem KCKT.
d) Linieritas dan Kurva Kalibrasi
 Uji linearitas dilakukan pada seri larutan standar tanin dengan konsentrasi tanin 2, 4, 6,
8 dan 10 ug/mL. Hasil uji diperoleh persamaan garis y = 645,6x dan koefisien korelasi
(r) 0,999.
e) Penetpan Kadar Kulit Buah Delima
 Hasil penetapan kadar tanin dalam ekstrak diperoleh sebesar 2,01%.
Pembahasan
1. Ekstraksi
 Pengambilan bahan dan zat aktif suatu tumbuhan dapat dilakukan dengan metode ekstraksi.
Ekstraksi adalah proses pemisahan, penarikan atau pengeluaran suatu komponen campuran
dari campurnnya.
 Pelarut yang digunakan adalah etanol yang bersifat polar. Etanol memiliki polaritas tinggi
sehingga mampu mengekstrak tanin lebih tinggi dengan tetapan derajat dielektrikum 24,30.
Penggunaan pelarut etanol dimaksudkan untuk mengekstrak senyawa tanin yang bersifat polar
dalam sampel. Pemilihan etanol sebagai pelarut juga didasarkan pada tingkat keamanan dan
kemudahan penguapan
 Sampel kulit buah delima diekstraksi menggunakan metode maserasi dan diikuti remaserasi.
Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam pelarut dengan beberapa
kali penggojokan atau pengadukan pada temperatur ruangan. Perendaman sampel simplisia
menyebabkan cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang
mengandung bahan zat aktif.
2. Analisis Kualitatif Kandungan Tanin
a. Analisis Kualitatif Kandungan Tanin dengan Metode Folin-Ciocalteu
 Uji keberadaan kandungan senyawa tanin secara kualitatif dilakukan menggunakan
metode Folin-Ciocalteu. Dari hasil pengamatan, warna biru yang dihasilkan
menunjukkan bahwa sejenis senyawa polifenol yang terkandung dalam ekstrak
adalah positif tanin sesuai dengan literatur bahwa kemampuan sampel untuk
mereduksi reagen Folin-Ciocalteu yang mengandung senyawa asam fosfomolibdat-
fosfotungstat, membentuk senyawa kompleks yaitu molibdenum tungstan yang
berwarna biru.

b. Analisis Kualitatif Kandungan Tanin dengan Metode KCKT


 Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan antara waktu retensi standar
senyawa kimia dengan waktu retensi baku pembanding. Pada analisis kualitatif
kandungan tanin dengan KCKT diperoleh waktu retensi standar tanin 16,518 menit.
Pada sampel ekstrak kulit buah delima putih menghasilkan kromatogram pada
waktu retensi standar tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa pada sampel yang
diteliti terdeteksi adanya tanin.
3. Analisis Kuantitatif Kandungan Tanin dengan
Metode KCKT
a. Penentuan Panjang Gelombang b. Pembuatan Larutan Baku Standar
Pengukuran Standar Tanin Tanin
 Untuk mengetahui panjang gelombang  Larutan standar tanin dibuat dengan
maksimum tanin maka senyawa tersebut melarutkan standar tanin dengan aquabidest
discanning pada spektrofotometer UV, dan disonikator selama 15 menit, lalu disaring
sehingga diperoleh spektra UV senyawa dengan membrane filter 0,22 μm. Sonikator
tersebut. Berdasarkan spektra yang selain difungsikan untuk menghilangkan gas-
diperoleh dapat digunakan untuk gas yang terlarut dalam larutan juga untuk
menentukan panjang gelombang yang akan menyebarkan nanopartikel yang masih dapat
digunakan pada detektor UV dalam melewati membrane filter 0,22 µm dalam
penetapan kadar tanin menggunakan baku larutan sampel (Khopkar, 2008). Hasil
eksternal. secara KCKTHasil scanning pembuatan larutan baku mendapatkan hasil
pada λ 200-400 nm diperoleh data bahwa yang larut dan sudah memenuhi syarat untuk
Amaks tanin adalah 275,5 nm. Panjang digunakan analisis dengan KCKT.
gelombang ini digunakan untuk
menganalisis kadar dengan KCKT.
3. Analisis Kuantitatif Kandungan Tanin dengan
Metode KCKT
c. Linieritas
 Linearitas ditentukan dengan membuat sebuah kurva kalibrasi hubungan antara
konsentrasi standar tanin dan luas area puncak. Penilaian linieritas suatu metode analisis
didasarkan pada nilai koefisien korelasi (r). Linieritas suatu metode analisis akan
semakin baik apabila nilai koefisien variasinya semakin mendekati satu.
 Kurva kalibrasi yang diperoleh memiliki persamaan garis y = 645,6x dan koefisien
korelasi (r) 0,999 untuk kisaran konsentrasi standar tanin 2, 4, 6, 8, 10 µg/mL.
 Menurut ICH (2005), nilai r yang dihasilkan telah memenuhi persyaratan, yaitu harus
lebih besar dari 0.990.
 Nilai r yang diperoleh mendekati satu sehingga dapat dikatakan bahwa kurva memiliki
kelinieran yang tinggi, artinya dengan meningkatnya konsentrasi tanin maka luas puncak
juga akan mengalami kenaikan yang linear, sehingga metode yang digunakan telah
memenuhi syarat linearitas untuk digunakan pada penetapan kadar tanin dalam sampel
ekstrak kulit delima.
3. Analisis Kuantitatif Kandungan Tanin dengan
Metode KCKT
d. Penetapan Kadar Tanin Total dalam Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT)
 Sampel yang digunakan untuk menetapkan kadar tanin adalah ekstrak kulit delima putih,
yaitu sebanyak 20 µL disuntikkan ke dalam sistem KCKT. Dari hasil KCKT tersebut
dideteksi banyak puncak, hal ini dikarenakan panjang gelombang yang digunakan pada
277 nm, kemungkinan senyawa yang bisa terdeteksi pada panjang gelombang tersebut
banyak. Tanin mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi oleh karena itu
menunjukkan pita serapan yang kuat pada daerah ultraviolet dan tampak.
Kesimpulan

This Photo by Unknown Author is licensed under CC BY


Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan maka dapat disimpulkan sebagai berikut :
1. Analisis kualitatif menggunakan metode Folin-Ciocalteu dan KCKT terbukti kulit buah delima
putih mengandung tanin.
2. Analisis kuantitatif dalam penetapan kadar tanin pada ekstrak kulit buah delima putih dapat
dilakukan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik yang
dilengkapi dengan detektor spektrofotometer UV.
3. Senyawa tanin ekstrak etanol kulit buah delima putih yang dianalisis dengan metode KCKT
diperoleh kadar rata-rata sebesar 2,01%.
Daftar Pustaka
Wahid, R.A.H. (2014). Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Tanin Ekstrak Kuli Buah Delima Putih
(Punica granatum L.) Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). [Karya
Tulis Ilmiah], 6-49.
Terima
Kasih