Discovering Genomics,

Proteomics And Bioinformatics

By A.Malcolm Campbell& Laurie J.Heyer

Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003

Teaching genomics to undergraduate students

is like vaccinating against flu:
Each year the novelties that have come to
dominate the field have to
be evaluated and course materials redesigned
to prepare the student
body for the ever-changing
information landscape.
Medicina Molecolare e Neoplasie
- Genetica - Analisi cromosomi

- Genomica - Analisi DNA

genomico/cDNA

- Proteomica - Analisi RNA

- Epigenetica - Analisi proteine

 Genetica Molecolare

Struttura e Funzione dei Geni

Genomica

Progetto Genoma - Sequenziamento

 1400nm

700nm

Gb
Mb (1000 Kb)
(1000Mb)

30nm

300nm Kb (1000 bps)

11nm

Nucleotide
2nm (1 bp)
 Human Chromosomes

p arm
Male 46,XY
centromere

q arm Female 46,XX

telomere
 Genome Anatomy

Transcribed gene
EUCHROMATIN 1,5%
1 gene 1 protein old dogma!

polymorphisms > 1 protein

98,5% NON CODING

intragenic = introns
Intergenic
repetitive
G-BANDING KARYOTYPE
 Cromosoma 12 Cloni/Sonde Geni
regione 12q12 regione 12q12
Metodi utilizzati

Cariotipo

Gene
Candidato
 FISH (PDGFRB 5q33)
Chromosome 5

9.4

3’
PDGFRB

q33

5’ COSMID 4-1 + COSMID 9-4

4.1

DUAL COLOR FISH

 M-FISH nl(5) der(5)
I-FISH

der(12)

der(12)
nl(5)

der(5)
 Interphase FISH

ABL1
D-FISH, dual colour dual fusion

ABL1
fusion

BCR fusion

normale Ph+
BCR
Braccio corto, p

Braccio lungo, q

banda gene
genecandidato
candidato separazione
rottura e (break apart)(split)
separazione

CROMOSOMA

sonda monocolore complementare a tutto il gene

sonde bicolore fiancheggianti il gene
 RT - PCR

RT: trascrizione inversa PCR : reazione a catena

della DNA-polimerasi
• Le molecole di mRNA (5’ 3’)
vengono retrotrascritte in Sintesi del filamento senso (5’ 
cDNA (filamento antisenso 3’) e amplificazione del cDNA
3’5’)
Filamento senso
5’ ------------------------AAAA 3’ mRNA
5’ 3’cDNA
cDNA
3’ 5’
Filamento antisenso
3’ 5’
VAL 617F in PV

PV

WT
 INS 959_960 CATG vs CCTG

WT
959

965

WT GATCT CT G GC AG T G G A G G AAGTCTCTTTAAGAAAATAG
B GATCT CT G CATG GC AG T G G A G G AAGTCTCTTTAAGAAAATAG
D GATCT CT G CCTG GC AG T G G A G G AAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Journal of Molecular Diagnostics,2006
 Types of genes wich may mutate to cause cancer

food

viruses Tumour suppressor genes

proto-oncogenes
chemical
DNA repair genes

checkpoint genes

tobacco smoke radiation

Proto - Oncogene
Oncogene è ciò
Un gene il cui
che risulta dal
prodotto ha la
proto-oncogene
capacità di
dopo insulto
indurre
genetico e il cui
trasformazione
prodotto ha la
cellulare a
capacità
seguito di insulti
trasformante
genetici
 Tumour Suppressor Genes

1) The gene’s normal function is to regulate cell division.

To lose gene activity both alleles need to be mutated

2) The first mutation may be inherited or somatic

3) the second mutation will often be a gross event leading

to loss of heterozygosity in the surronding area (deletion)

es: retinoblastoma gene (13q14)

 Retinoblastoma Gene (13q14)
both copies of gene as to be inactivated

somatic mutation heredity

first allele inactivation

somatic mutation

second allele inactivation

p53 Mutant Mice Develop Cancer
Mutazione dominante negativa

Una mutazione il cui prodotto

interferisce con il prodotto del gene

normale nella stessa cellula

 REPAIR GENES

• BER Base Excision Repair

• NER Nucleotide Excision Repair

• MMR Mismatch Repair (HNPCC)

Checkpoints Genes

Sistema cellulare di protezione dall’instabilità

genomica e della tossicità derivata dal danno al
DNA
Functional Goals Of Mutations
• Induzione di segnali di crescita

• Perdita di capacità di sopprimere

• Regolazione anormale dell’apoptosi

• Diminuzione della stabilità genomica

• Evasione delle difese immunologiche

 Proteomica

Caratterizzazione della neoplasia attarverso le

sue proteine
( elettroforesi bidimensionale: gradienti di pH +
peso molecolare - spettrometria di massa )
Dogma Della Biologia

DNA

RNA Proteine
Microarray showing genes
distinguishing ALL from AML.
The 50 genes most highly
correlated with the ALL-AML
class distinction are shown. Each
row corresponds to a gene, with
the columns corresponding to
expression levels in different
samples. Expression levels for
each gene are normalized across
the samples such that the mean is
0 and the SD is 1. expression
levels greater than the mean are
shaded in red, and those below
the mean are shaded in blue. The
scales indicated SDs above or
below the mean.
 Epigenetica:

( Espressione Genica )

Metilazione
De-acetilazione
RNA interferents
Epigenetica: Metilazione

* * *
ATG

5’- Promoter exon 1 exon 2 exon 3 -3’

* CpG Island: Sequenze di DNA di 200-2000 basi con una più

alta frequenza di CG rispetto al resto del
genoma.
Circa 30000 nel genoma, il 50-60% è localizzato
all’interno dei promotori genici.
La metilazione del promotore a livello delle
CpG è associata a silenziamento trascrizionale
e deacetilazione degli istoni.
 Copia inattiva Copia attiva
del gene (“imprinted”) del gene

• acetilazione istonica
• acetilazione istonica • metilazione
• metilazione

attività deacetilasica repressione della trascrizione

attività acetilasica attivazione della trascrizione
 INIBITORI

Azacitidina, Decitabina, Zebularina

Acido Valproico, Tricostatina A,

SAHA, Fenil-butirrato, MGCD0103

Substrati non-Istonici
Fattori di trascrizione
Bartel DP, Cell 2004;116:281-297
t(9;22)(q34;q11) D-FISH
normal BCR/ABL1

BCR/ABL1 + loss 5'ABL1 BCR/ABL1 + loss 5'ABL1/3'BCR

der(9)
 + DNA probe+apten
DNA target

DENATURATION DETECTION
Ab
I) anti-apten

Ab
HYBRIDIZATION II)
Mutations can be
induced by
chemical
modification
of a base
B.G. 138/00
Tecniche di Citogenetica e di Biologia Molecolare
 Epigenetica:

( Espressione Genica )

Metilazione
Acetilazione
RNA interferents
Bartel DP, Cell 2004;116:281-297
 Gene
Expression
is
a multistage
process
WHO Integrated Classifications
Morphology: Immunology:
Cytology Immuno-cyto-
Histopathology histochemistry

Molecular
Cytogenetic Genetics
The New England Journal of Medicine. Jan 4, Vol 356, No. 1, 79-81
Eredità di tipo Mendeliano
Dominante
Recessiva

Penetranza
 Cancers Selected Syndromes

Selected human
cancers
associated
with
Mendelian
syndromes
 Oncogeni
Proto - Oncogeni (c-onc)
Mutazioni
Virus RNA
Oncogene tumorali
(v-onc)
spliced RNA copies
of the c-onc
no introns
 Domande
• Che cos’è la citogenetica molecolare ?
• Che cos’è un oncogene ?
• Che cos’è un gene checkpoint ?
• Che cosa studia l’epigenetica ?
• Quale è la differenza tra DNA genomico e cDNA ?
• Strumenti di analisi dell’espressione genica
• Che cos’è un gene soppressore?
• A cosa servono i telomeri?
B.G. 138/00
• Enhanced Mutagenesis Spontaneous
biosynthetic errors induced by
endogenous/exogenous agents

• Inefficient repair

• Clonal selection
 REPAIR GENES

• BER Base Excision Repair

• NER Nucleotide Excision repair

• MMR Mismatch repair (HNPCC)

GEL ELETTROFORETICO IN AGAROSIO

123 bp ladder /Hind III

Migrazione Elettroforesi
 I-FISH
-NUMERICAL ABERRATIONS

Monosomy / Trisomy

Amplification

-STRUCTURAL ABERRATIONS

Deletion / Duplication

Translocation / Inversion
Epigenetica:Metilazione Methylation Specific PCR (MSP)

‘‘U’’ Primer:
Trattamento con Sodio Bisulfito
NH2
* *O * DNA NON metilato:
CACATTACCACTAAC
N Deaminazione NH 5’…. GUGTAATGGUGATUG ….3’
ATG

5’- O Promoter DNA

exon 1 metilato:
exon 2 exon 3 -3’
N N O
H H CACATTACCACTAAC

* CpG Island:
CITOSINA
Sequenze diURACILE 5’…. GCGTAATGGCGATCG
DNA di 200-2000 basi con una più….3’
alta frequenza di CG ‘‘M’’ rispetto
Primer: al resto del
NH2
genoma. NH2 DNA NON metilato:
CH3 CH3 CGCATTACCGCTAGC
N Circa 30000 nelNgenoma, il 50-60% è localizzato
Deaminazione
all’interno dei promotori5’….
genici.
GUGTAATGGUGATUG ….3’
N O N O
H La metilazione
H del DNA
promotore
metilato: a livello delle
5-metilcitosina CpG è associata
5-metilcitosina
CGCATTACCGCTAGC
a silenziamento trascrizionale
e deacetilazione degli istoni.
5’…. GCGTAATGGCGATCG ….3’