Programa de Ps-Graduao em Biologia Geral e Aplicada.

Defesa de Mestrado

EFEITO GENOTXICO DA ARTEMISININA E DO ARTESUNATO EM CLULAS DE MAMFEROS

Mestranda: Ivani Aquino Orientador: Prof. Dr. Edson Luis Maistro

Artemisinina e Artesunato - relevncia clnica (MESHNICK et al., 1996; DHIGRA et al., 2000;
OLLIARO, 2001).

A malria: 300 a 500 milhes de casos clnicos e quase trs milhes de bitos a cada ano (WHO, 2008).

Resistncia teraputica cloroquina.

Artemisia annua

Princpio ativo: Artemisinina Derivado qumico: Artesunato

 Potencial genotxico em clulas tumorais e clulas de roedores, in vitro (Efferth et al., 2003;
Efferth et al., 2007; Hou et al., 2008; Paul et al., 2008; Cai et al., 2010; Chen et al., 2010; Du et al., 2010).

In vivo: poucos trabalhos.

Artemisinina: no h estudo publicado sobre seu potencial genotxico/mutagnico sobre clulas HepG2.

GENTICA TOXICOLGICA
pesquisa de genotoxicidade e mutagenicidade de agentes aos quais os organismos esto expostos;

uso de testes que avaliam o dano que os agentes podem causar ao DNA.
(COSTA, 2006)

Ensaio Cometa
avalia os danos no DNA de clulas individuais causados pela substncia testada. baseada na corrida de fragmentos de DNA em relao ao ncleo principal, sob eletroforese, produzindo aspecto semelhante a um cometa:

Etapas Ensaio Cometa

Teste de Microncleo
pequena massa nuclear delimitada por membrana e separada do ncleo principal.

Fragmentos cromossmicos acntricos ou de cromossomos inteiros

CLASTOGENIA

ANEUGENIA

Etapas in vivo

Anlise da Expresso Gnica

Amplificao e deteco em um s passo; Baseado em deteco e quantificao de um sinal fluorescente.

Anlise da Expresso Gnica

Analisa se o tratamento com as substncias teste interfere na expresso de genes de interesse; CASP3 apoptose; SOD1 neutralizao de radicais livres.

Justificativa
A importncia da malria; O uso da artemisinina e do artesunato; Poucas estudos quanto toxicidade e segurana.

Objetivos
Avaliar a capacidade de diferentes concentraes da artemisinina e do artesunato de induzir danos ao material gentico, in vivo e in vitro, atravs da utilizao do Ensaio Cometa e do Teste do Microncleo; e ainda avaliar se existe alterao na expresso dos genes envolvidos com o processo de apoptose (Casp 3) e neutralizao de radicais superxidos (SOD1), in vitro.

Objetivos Especficos
Avaliar a citotoxidade da artemisinina e do artesunato em diferentes concentraes, em cultura de clulas HepG2, atravs de Teste com Rezasurina. Investigar a induo de danos ao material gentico em clulas HepG2 tratadas com as duas substncias, atravs do Ensaio Cometa.

Objetivos Especficos
Avaliar a expresso dos genes Casp 3 e SOD1, em clulas HepG2 tratadas com artemisinina e artesunato, atravs da PCR em tempo real.

Investigar a induo de danos ao material gentico em clulas de sangue perifrico, fgado e medula de camundongos Suos albinos, tratadas com artesunato, atravs do Ensaio Cometa e do Teste do Microncleo, in vivo.

Artigo 1 Genotoxicity assessment of the antimalaric compound artesunate in somatic cells of mice.
Ivani Aquino, Fbio Ferreira Perazzo and Edson Luis Maistro

Submetido ao Journal of Applied Toxicology

Material e Mtodos
Artesunato Doxorrubicina 6 grupos Ensaio Cometa Teste de Microncleo

Resultados

Tabela 1 Ensaio Cometa em clulas de sangue perifrico

Treatments

Tabela 2 Ensaio Cometa em clulas de fgado.

Treatments

Tabela 3 - Teste de Microncleo em Eritrcitos Policromticos

Treatments

Discusso
Ensaio Cometa: ART em baixas doses apresentou genotoxicidade baixa, mas em alta dose e aps metabolizao no fgado, apresentou alta genotoxicidade.

Li et al. (2008), utilizando clulas CHO-9 e V79-2 verificaram atravs do Ensaio Cometa que, in vitro, o artesunato induzia danos no DNA e apoptose, sugerindo estresse oxidativo.

Discusso
Quando a proliferao normal das clulas de medula afetada por um agente citotxico, a relao PCE/NCE tambm diminui (Gollapudi and McFadden, 1995). Na dose de 2000 mg/kg, a relao PCE/NCE em clulas do fgado foi de 0,67 0,04 (p<0,001), menor at que a Doxorrubicina, que apresentou uma relao de 0,98 0,04. provvel que o artesunato na dose mxima testada, por ter mostrado citotoxicidade atravs da razo de PCE/NCE e alta genotoxicidade evidenciada pelo ensaio cometa, tenha inviabilizado a diviso celular nas clulas da medula, no permitindo que as clulas filhas micronucleadas fossem evidenciadas.

Discusso
apresentou atividade Artesunato clastognica/aneugnica nas 3 maiores doses testadas ; Trabalhos sugerem que a atividade citotxica do artesunato pode indicar uma efetiva ao no combate ao cncer (Efferth et al., 2003; Efferth et al.,
2007; Hou et al., 2008; Cai et al., 2010; Chen et al., 2010; Du et al., 2010);

Porm, neste estudo, o artesunato apresentou atividade genotxica e mutagnica, o que poderia inviabilizar o uso desta substncia no tratamento da malria e como droga anticancer.

Concluso
Nossos resultados indicam que o artesunato apresenta efeito citotxico na maior dose utilizada, alm de exibir atividade clastognica/aneugnica em eritrcitos jovens de medula ssea. Alm disso, o artesunato induziu poucos danos no DNA em clulas no metabolizadoras de sangue perifrico, mas grandes danos ao DNA, em alta dose, em clulas metabolizadoras, como o fgado.

Artigo 2 Expresso de SOD1 e Caspase 3 e efeito genotxico em clulas HepG2 tratadas com artemisinina e artesunato
Ivani Aquino, Marcela Stefanini F. Tsuboy, Juliana Cristiana Marcarini, Mrio Srgio Mantovani, Fbio Ferreira Perazzo and Edson Luis Maistro

A ser submetido Toxicology in vitro

Material e Mtodos
Artemisinina e Artesunato Doxorrubicina HepG2 Citotoxicidade com Rezasurina Ensaio Cometa (de acordo com as premissas de Tice
et al., 2000 )

Anlise da expresso gnica por qRT-PCR

Citotoxicidade in vitro
[2,5], [5], [7,5], [10] e [20 g/mL] ATM e ART 5x104 clulas 24 poos Delineamento: 1. 24h estabilizao; 2. 24h tratamentos; 3. 3h 750L de soluo de resazurina 60M Victor 3, PerkinElmer-faixa de 530-560 nm de excitao e 580-600nm de emisso

Ensaio Cometa
106 clulas por frasco; [2,5], [5] e [10 g/mL]; Semeadura tratamento 24h estabilizao 3h

Viabilidade Celular: Azul de Trypan - >95%

Anlise da Expresso Gnica

106 clulas por frasco; 24 h de estabilizao; 12 h tratamento com [5 g/mL] ATM e ART; Extrao do RNA: Trizol, de acordo com o fabricante (Invitrogen); Integridade do RNA: Gel (visualizao do padro de bandas dos RNAr 18S e 28S) e quantificao em espectrofotmetro (razo A260/A280);

Anlise da Expresso Gnica

Sntese do cDNA; Reaes de PCR tempo real; Primers: CASP3: fornecedor ( http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest ) 2. SOD1: Ding et al. (2004) 3. GAPDH - normalizador 1.

Resultados

Fig. 1. Resultados das mdias das duplicatas do Ensaio de Citotoxicidade com Resazurina

Tabela 1 Total e scores de danos em clulas HepG2 tratadas com Artemisinina e Artesunato

Tratamentos

Amostra

Quantificao 1375 g/mL 1687 g/mL 1610 g/mL 1612 g/mL 1413 g/mL 1399 g/mL

Razo 2.04 2.01 2.03 2.03 2.04 2.04

Integridade do RNA

C1 C2 ART 1 ART 2 ATM 1 ATM 2

Ladder

C1

ART1

ATM1

C2

ART2

ATM2

28S 18S

Fig. 2. Expresso relativa dos RNAm de CASP3 e SOD1, quantificado por PCR em tempo real na linhagem HepG2.
2 1,5 1 1 0,5 R 0 CASP3 -0,5 -1 -1,156 -1,5 controle artemisinina artesunato SOD1 1,151 1,105 1 1,392

Discusso
Citotoxicidade: aps 24h, [7,5], [10] e [20] foram citotxicas; ATM e ART em todas as concentraes testadas, induziram a leses no DNA (p<0,001) ; Autores sugerem que a ATM e o ART apresentam efeitos citotxicos, alteram o ciclo celular e induzem apoptose (Hou et al., 2008; Li et
al., 2008; Youns et al., 2009; Du et al., 2010; Zhang et al., 2010).

Discusso
Analisamos a expresso gnica da CASP envolvida quase todas as vias apoptticas; 3,

ATM e ART: aumento na expresso de CASP3, no significativo, o que pode sugerir que ambas as substncias alteram o ciclo celular, porm no induziram a apoptose. ATM: a expresso de SOD1 aumentada em relao ao controle, enquanto o grupo tratado (dados no significativos); ART: apresenta uma diminuio da expresso deste gene (dados no significativos).

Discusso
Como a SOD1 s teve a expresso aumentada pelo tratamento com ATM, talvez ela tenha maior potencial de gerar estresse oxidativo do que o ART;

Youns et al. (2009): pequena diminuio da expresso de SOD1 ao tratar clulas pancreticas com artesunato.

Concluso
Tanto a ATM quanto o ART apresentaram efeito genotxico e alteraram a expresso de mRNA da caspase 3, protena efetora na cascata apopttica, podendo indicar que em concentraes maiores, a citotoxicidade encontrada pode ser devida a elevados danos no DNA que por sua vez, desencadeiam a via de apoptose.

Consideraes Finais

 O ART mostrou-se genotxico em in vivo e in vitro; O ART mostrou-se mutagnico, in vivo; Tanto o ART quanto a ATM apresentaram efeito genotxico in vitro; No alteraram significativamente a expresso dos genes CASP3 e SOD1.

OBRIGADA!