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Anticuerpos monoclonales

Biologa Molecular Mara Josse Vsquez Meja Juan Antonio Garca Fraga Sendar Daniel Nery Flores

Los Anticuerpos han sido una herramienta importante de la biloga, bioqumico e inmunlogo por dcadas, pero fue el desarrollo de hibridoma tecnologa por Kohler y Milstein' y la capacidad para producir especficos anticuerpos (anticuerpos monoclonales o mAbs) que ha revolucionado nuestra capacidad de enfoque un amplia gama de problemas en biomdica investigacin. La respuesta 'policlonal' conduce a la generacin de muchos diferentes anticuerpos que reconocen el antgeno original . Inmunizacin repetida ('hiper-inmunizacin') , por ejemplo, un antgeno de protenas, conduce a la seleccin de alta produccin de las clulas b anticuerpos de afinidad en los ganglios linfticos (maduracin de la afinidad). Los sueros de estos animales hiperinmune contienen un nmero de anticuerpos especficos para un antgeno (policlonal) y si bien esto puede ser bien para muchos usos impide anlisis de los eptopos individuales involucrados

El mtodo es esencialmente directa, es decir, fusionar una produccin de clulas B el anticuerpo deseado con un continuo crecimiento cell line de mieloma placa en un medio selectivo que contengan hipoxantina,aminopterina y timina (HAT). La lnea celular de mieloma ha perdido la enzima hipoxantina guanosina fosforribosil tranferase (HGPRT) y no puede sintetizar ADN en presencia de los nucletidos y el cido flico inhibidor aminopterina.

El procedimiento original que describe la formacin hibridoma ' utilizados plasmocitomas inducida por aceite mineral (MOPC) de ratones BALB/c que haban sido seleccionados en 8-azaguanina que carecan de la transferasa de enzima hipoxantina guanosina fosforribosil (HGPRT). Estas clulas son incapaces de utilizar la va de salvamento para sntesis ADN y en consecuencia, morir en medios de comunicacin que contiene aminopterina o metotrexato. Hoy, la mayora de hibridomas est preparada utilizando un nmero de diferentes derivados de tales mielomas de ratn.

Lneas celulares de mieloma se derivan de los ratones BALB/c, Los bazos de estos animales se han utilizado habitualmente como la fuente de clulas linfoides inmunes. Sin embargo, es posible generar heterohybridomas usando B-clulas inmunitarias de otros animales y fusin con clulas de mieloma. La razn para hacer monoclonales reactivos de ovejas o conejos es que se espera que la afinidad de los anticuerpos sustancialmente mayor que las obtenidas de ratones. La Formacin de hibridoma requiere la fusin exitosa de una celula B con su mieloma.

Pueden utilizar muchos tipos diferentes de inmungeno, por ejemplo, clulas enteras, macromolculas como ADN Precipitado, las protenas purificadas, glicoprotenas e hidratos de carbono, protenas recombinantes, expresadas en las bacterias, levaduras, insectos o clulas de ovario de hmster chino. Donde el recombinante las protenas son normalmente glucosilada, agregan de las cadenas de lado de hidratos de carbono sern los de la especie en la que se expresan. Dichas modificaciones puede mostrar inmunogenicidad diferencial en comparacin con el original glicoprotena, por ejemplo, si es de origen humano. Derivan de pptidos basados en secuencias de ADN han sido ampliamente utilizadas para producir antisueros policlonales en conejos, pero a menudo son mal inmungena en ratones y ratas.

Para obtener el mayor nivel de respuesta de los anticuerpos, pptidos, protenas y otras macromolculas solubles son generalmente emulsionadas con un adyuvante para dar una emulsin relativamente estable que acta como una liberacin lenta agente. Adyuvante ms usualmente empleada es Freund de que contiene el aceite de Crotona promotor de tumor junto con micobacterias muertos de calor que actan como atrayentes para las clulas presentadoras de antgeno fagocticas como macrfagos (de Freund completa adyuvante, FCA). Los animales se re-immunized a intervalos de 1 semana se toman muestras de sangre y 1 mes antes a la inmunizacin. Muestras de suero se evalan la aparicin de anticuerpos especficos y Cuando el ttulo se considera suficientes los animales reciben una final la inmunizacin y luego asesinado y el bazo eliminado 3-4 das ms tarde.

Los mielomas debe mantenerse en crecimiento exponencial antes de la fusin luego hilar, lavarse dos veces en serumfree medio y resuspensin en medio libre de suero en 1-2 x clulas de lo7 mljusto antes de su uso. El tejido linfoide es desglosado a travs de una malla de acero inoxidable (colador estril de t) utilizando una esptula estril (en alcohol y flameado) y las clulas recogidas por centrifugacin. Despus de tres lavados en medio libre de suero son las clulas resuspendidas a 5 x 107-108 linfocitos ml-'.

la mayora de los hibridomas son generados por la adicin de polietilenglicol a fusin de las membranas celulares del mieloma y clulas B. Los socios de fusin mezclado a dar sobre los esplnico linfocitos y clulas de mieloma (ratn) o mieloma clulas (rata) se someten a centrifugacin en un tubo de ronda final de 10 ml. Despus de la eliminacin del sobrenadante la pellet es aflojado punteando el tubo y luego de 1 ml de polietilenglicol 1500 (50% en medio) es provocado lentamente en el sedimento ms 1-2 min para inducir fusin celular. La suspensin es entonces diluyendo con medio slo con un mnimo de 1-5 ms y, a continuacin, diluida en medio (DMEM o RPMI) que contiene el 20% de suero de ternera fetal, hipoxantina, aminopterina y timina (medio de seleccin HAT) y revestidos en placas pocillos.

La mezcla de fusin es revestida como 2 ml alcuotas en cuatro placas , utilizar placas de 96 pocillos mltiples para facilitar la seleccin de hibridomas positivos. Incubar a 37 C en un ambiente de 5% CO2 y examinado despus 7-10 das para la presencia de colonias de hibridoma. Dejar encubar el tiempo necesario para produccin de anticuerpos especficos.

Con el aislamiento de ADN polimerasas termoestables y la PCR ha sido relativamente sencillo aislar y clonar los genes de la inmunoglobulina

Clulas B o Hibridomas

Los procedimientos se basan en el conocimiento de las secuencias del ADN de roedores y humanos

Facilitado la produccin de primers necesarios para la amplificacin de secuencias de ADN mediante PCR

Aislamiento y clonacin de las regiones para VH y VL, ya que contienen las regiones CDR.

Ligamiento de los productos de gnicos de VH y VL

Capacidad de unin al Ag Insertar en fagmidos Generar bibliotecas de genes de las inmunoglobulinas Generacin de scFv

Clulas esplnicas o de hibridoma

Homogenizar en solucin 4M de tiocinato de guanidina

Agregar cloroformo

Mezclar con fenol

ase acuosa: Separacin de fases

Interfase o fase org nica: A protenas

El RNA es precipitado de la fase acuosa con isopropanol y con lavados de etanol al 75%. Lavas con una solucin buffer

El mRNA contiene una cola de poli(A).

Membrana de dT-celulosa

Sintetizar ADNc

mARN Primers dNTPs Reverso transcriptasa de AMV

La mezcla de PCR contiene:

4 dNTPs DNA polimerasa Primer directo y primer reverso

Primers reversos (5-3) elegidos por las secuencias que inician a la regin de VH o VL

Primers directos (3-5) elegidos por las secuencias que inician a las regiones de dominios constantes

Amplificacin por PCR Electroforesis

La secuencia del ligador es complementaria a la secuencia de los primers de VH o VL

Los ligadores se agregan al producto amplificado de la PCR

Fragmentos de anticuerpos scFv

Se efecta una segunda PCR

pHEN-1 contiene orgenes de replicacin de E. coli y de fagos, ms un gen de resistencia a ampicilina. Promotor Lac Z

Sitios de restriccin para Sfi I / Not I

Para insertar los genes scFv en el fagmido, se cortan con las mismas enzimas de restriccin, luego son ligadas con la ligasa de T4 y se introducen a E. coli TG1 mediante electroporacin

Utilizados en diferentes aplicaciones inmunolgicas como ELISA o Western Blot

Inocular medio de glucosa con la colonia que contenga la clona de inters

Despus de 4 horas a 30C las clulas se centrifugan. Se resuspenden en una solucin de Tris-HCl a un pH 8 que contiene 20% de sacarosa y 1mM de EDTA

Las clulas se colocan en un medio libre de glucosa y que contiene ampicilina, tambin se agrega el inductor IPTG

Sobrenadante contiene el scFv

Los anticuerpos monoclonales son utilizados para el aislamiento, identificacin y localizacin celular de productos gnicos especficos

CD8+ Linfocitos TC

Diferenciar las poblaciones de leucocitos por medio del CD identificado con los anticuerpos monoclonales

CD4+ Linfocitos TH

MHC I

MHC II

Anticuerpos contra determinantes antignicos presentes en clulas T como el CD3

Prevencin de rechazo a un injerto

Anti-CD20 para tratar linfoma de clulas B Anticuerpos dirigidos contra diversos cnceres Anti-PEM para tratar el cncer de ovario