PENGUJIAN IN

VIVO
ANTIOKSIDAN
Almira Azalia Fridayanti
1800023122
 Parameter pada
Pengujian In Vivo
⬢ Superoksida Dismutase (SOD)
⬢ Katalase
⬢ Glutathione Peroksidase

2
1
Superoksida Dismutase
(SOD)
 “
Prinsip dari Superoksida Dismutase yaitu
dilakukan dengan menggunakan metode Uji aktivitas
dan Gel aktivitas. Prinsip pengujian parameter
didasarkan pada kemampuan O2- untuk berinteraksi
dengan NBT yang mereduksi tetrazolium kuning di dalam
gel menjadi endapan biru. Metode tambahan yang dapat
digunakan untuk menentukan aktivitas SOD adalah Uji
Sitokrom C atau Uji Langsung berbasis Kalium
Superoksida. Analisis alternatif uji langsung SOD
berbasis Kalium Superoksida ditentukan pada pH yang
mengubah aktivitas MnSOD.

4
 Teknis Pengujian
Metode gel aktivitas SOD WAKTU 24 jam :
⬢ Bersihkan pelat kaca dengan metanol atau etanol untuk membersihkan permukaan dari kotoran,
pastikan tidak ada retakan atau serpihan di pelat. Pasang pelat di peralatan penjepit gel dan
dudukan menggunakan spacer 1,5 mm, sehingga membuat gel "tebal".
⬢ Untuk gel bernoda SOD, jalankan sampel duplikat pada dua gel asli 12% (vol / vol). Tambahkan
semua reagen menjadi satu dalam tabung kerucut 50 ml dan aduk rata. Tambahkan larutan ke unit
pelat kaca sekitar 1 cm dari bagian atas peralatan menggunakan pipet Pasteur kaca berukuran 5
3⁄4 ”. Perlahan tambahkan lapisan air di atas gel yang mengalir sampai seluruhnya tertutup.
Pastikan peralatan rata dan tunggu selama 20 hingga 30 menit polimerisasi gel. Antarmuka dapat
dengan jelas dilihat antara lapisan air dan gel saat polimerisasi selesai.
⬢ Persiapan gel susun : Setelah gel pemisah terpolimerisasi, siapkan susunan 5% (vol / vol).
Campur semua reagen menjadi satu dalam tabung kerucut 50 ml. Tambahkan ke permukaan gel
yang sedang mengalir, isi rakitan kaca ke atas dengan gel susun. Tambahkan 1,5 mm, dengan
sudut untuk menghindari gelembung udara di bawah permukaan sisir; ini penting untuk
menjalankan sampel Anda dengan benar. Letakkan peralatan gel di bawah lampu fluoresen atau di
atas kotak lampu untuk membantu reaksi polimerisasi. Di bawah cahaya, polimerisasi akan terjadi
dalam 15-30 menit. 5
⬢ Pra-Elektroforesis .
Setelah gel dipolimerisasi, lepaskan sisir dan rakitan gel dari dudukan pengecoran. Pasang rakitan
gel ke rakitan elektroda dan tempatkan ke dalam peralatan elektroforesis (boks). Tuang penyangga
praelektroforesis ke dalam reservoir dan ruang peralatan kotak dan tambahkan tutup sel peralatan.
Pra-elektroforesis gel selama 1 jam, pada 40 mA pada 4 ° C. Untuk hasil terbaik, biarkan gel
semalaman pada suhu 4 ° C. Langkah Kritis : Langkah pra-elektroforesis menghilangkan sisa
APS, TEMED, dan produk polimerisasi tidak lengkap yang dapat menonaktifkan protein asli.
⬢ Mengisi gel.
Biarkan gel dalam buffer pra-elektroforesis. Bersihkan sumur dengan pipet Pasteur kaca berukuran
5 3⁄4 inci untuk menghilangkan sisa reagen gel. Siapkan sampel, dengan mengencerkan stok
sampel 1: 1 dalam memuat buffer gel dan menambahkan sampel ke sumur. Untuk sampel yang
disiapkan untuk kultur sel, muat 50 - 250 μg protein per Sampel. Biasanya 150 μg akan
menghasilkan pita yang berbeda. Untuk homogenat jaringan, muat 50 - 100 μg protein per sampel.
⬢ Elektroforesis.
Jalankan sampel dalam buffer pra-elektroforesis selama 3 jam pada 40 mA pada 4 ° C. Setelah 3
jam, lepaskan set-up gel dan tuangkan praelektroforesis penyangga. PAUSE POINT Gel dapat
dibiarkan pada suhu 4 ° C selama 18-24 jam.

6
⬢ Tambahkan buffer elektroforesis ke reservoir dan ruang peralatan. Lari gel selama sekitar 2-3
jam lebih (40 mA, 4 ° C). Untuk memastikan protein sudah masuk gel, perhatikan garis
pewarna di bagian atas bagian depan pewarna sampel. Begitu pewarna depan mencapai dasar
gel, jalankan gel selama 1 jam lagi.
⬢ Pewarna gel dengan pewarna gel asli SOD. Tempatkan satu gel dalam wadah plastik atau kaca
mengandung 40 ml pewarna SOD total dan gel lainnya dalam 40 ml pewarnaan MnSOD.
Noda selama 20 menit pada suhu kamar, goyangkan dalam gelap atau ditutup dengan foil.
⬢ Setelah inkubasi, bilas gel secara lembut dengan ddH2O dua kali. Tambahkan secukupnya
ddH2O untuk menutupi gel dan tempatkan di bawah lampu fluorescent dan di atas kotak
lampu. Itu gel akan mulai berubah menjadi biru / ungu dan pita bening akan muncul secara
bertahap. Meninggalkan di bawah lampu, dan di kotak lampu selama 15 menit hingga 2 jam
pastikan gel tidak menyala mengering.
⬢ Setelah pita muncul, cuci tiga kali selama 10 menit dengan air. Biarkan gelnya untuk duduk
pada suhu kamar selama 18-24 jam dalam air di bawah cahaya sekitar untuk memungkinkan
pengembangan band selanjutnya.
⬢ Matikan lampu. Band akan meningkat selama 4 hingga 24 jam ke depan. Akhromatis pita
menunjukkan adanya SOD.12. Gambar gel pada pemindai alas datar komputer dengan cahaya
dari atas dan bawah atau memanfaatkan sistem pencitraan lain yang tersedia.
7
2 Katalase
Prinsip Pengujian Katalase
prinsip pengujian parameter yang
didasarkan prosedur spektrofotometri
yang mengukur penghilangan
peroksida. Dengan uji langsung
dengan kinetika pseudo-first order
dan diukur dengan metode Beers and
Sizer. Pada akhir pengujian, H2O2
ditambah dan katalase menjadi tidak
aktif.

9
 Teknis Pengujian
Analisis katalase menggunakan uji aktivitas dalam gel TIMING 24 jam :
⬢ Untuk gel katalase, siapkan gel asli 8% (vol / vol). Hanya satu gel yang
dibutuhkan untuk setiap enzim antioksidan. Langkah Kritis : Jalankan gel pada
suhu 4 ° C. Semua langkah pewarnaan dilakukan pada suhu kamar.
⬢ Siapkan sample dengan mengencerkan stock 1: 1 pada loading gel buffer dan
tambahkan sampel ke sumur. Untuk sampel yang disiapkan untuk kultur sel,
muat 50 -100 μg. Untuk homogenat jaringan, memuat 50-100 μg protein per
sampel. Muat kontrol positif untuk katalase (katalase sapi, 10 mU) atau GPx
(sapi atau GPx manusia, 50 mU).
⬢ Siapkan dan jalankan semua aspek lain dari pengujian untuk gel aktivitas SOD
(lihat cara pengujian SOD 1-7).
⬢ Keluarkan gel dari piring kaca dan taruh di piring pewarna kaca.
⬢ Cuci gel 3 × 10 menit dalam air suling.
10
Teknis Pengujian
⬢ 6. Siapkan larutan 0,003% H2O2 dengan mencampurkan 10 μl H2O2 (larutan 30%, vol /
vol) dengan 100 ml ddH2O dalam gelas kimia dengan batang pengaduk. Inkubasi gel di
dalam 0,003% H2O2 (vol / vol) selama 10 menit.7. Siapkan noda dalam dua tabung kerucut
50 ml; dengan membuat 2% besi klorida (wt /vol, 0,6 gram dalam 30 ml air suling) dalam
satu tabung dan dalam tabung kedua disiapkan 2% potassium ferricyanide (wt / vol, 0.6 gm
dalam 30 ml air suling).
⬢ 8. Bilas gel dari gel Langkah 6 dua kali dengan ddH2O dua kali selama 5 menit. Kemudian
Tuang air.
⬢ 9. Tambahkan noda ke gel. PERHATIAN Ferric chloride dan potassium ferricyanide
bersifat kaustik dan akan pergi noda yang tak terhapuskan
⬢ - GUNAKAN SARUNG TANGAN! LANGKAH KRITIS : JANGAN CAMPUR 2 reagen
sebelum pewarnaan, tuangkan bersama-sama langsung di atas gel.
⬢ 10.Saat pita akromatis mulai terbentuk, buang noda dan bilas secara ekstensif dengan
ddH2O.
⬢ 11. Gambar seperti yang dijelaskan dalam langkah SOD (Langkah 9-12).
11
3 Glutathione Peroksidase
Prinsip Pengujian Glutathione Peroksidase

Pengujian ini memanfaatkan glutathione disulfide

(GSSG) yang dibentuk oleh aksi enzimatik GPx dan
diregenerasi oleh kelebihan glutathione reductase
(GR) dalam pengujian. Aksi GR dipantau dengan
mengikuti hilangnya co-substrat NADPH pada 340
nm seperti yang terlihat pada skema reaksi.
Pencatatan uji kehilangan NADPH mengukur
reduksi H2O2 oleh GPx menjadi alkohol. Untuk
menentukan aktivitas GPx di dalam sampel.

13
Teknis Pengujian
⬢ Analisis Glutathione Peroksidase menggunakan uji aktivitas dalam gel :
⬢ Untuk gel aktivitas GPx, siapkan 8% gel asli. Hanya satu gel yang dibutuhkan untuk
masing-masingnya enzim antioksidan. LANGKAH Kritis : Jalankan gel pada suhu 4 ° C.
Semua langkah pewarnaan dilakukan pada suhu kamar.
⬢ Siapkan dan jalankan semua aspek lain dari pengujian untuk gel aktivitas SOD (Langkah 1
-7). Untuk sampel yang disiapkan untuk kultur sel, muat 200-300 μg protein per Sampel.
Untuk homogenat jaringan, muat 100-200 μg protein per sampel.
⬢ Buat larutan GSH 1 mM dengan melarutkan 93 mg GSH dalam 300 ml ddH2O.
⬢ Keluarkan gel dari piring kaca dan taruh di piring pewarna kaca.
⬢ Cuci gel 3 × 10 menit dalam air suling yang mengandung GSH menggunakan sekitar 50 ml
per mencuci. LANGKAH Kritis : Mencuci gel dengan GSH yang mengandung air
memungkinkan gel untuk menyerap substrat ini yang diperlukan agar GPx berfungsi selama
bagian pewarnaan protokol.

14
Teknis Pengujian
⬢ Siapkan noda dalam dua tabung kerucut 50 ml dengan membuat 1% besi klorida (wt /vol,
0,3 gm dalam 30 ml ddH2O mengandung GSH) dalam satu tabung dan dalam tabung kedua
menyiapkan 1% kalium ferricyanide (wt / vol, 0,3 gram dalam 30 ml ddH2O yang
mengandung GSH).
⬢ Inkubasi gel dalam 100 ml ddH2O yang mengandung 0,008% cumene hidroperoksida (vol/
vol, 10 μl larutan 80%) selama 10 menit.
⬢ Setelah itu, Bilas gel dua kali dengan ddH2O dan tuang air.
⬢ Inkubasi gel dengan noda yang telah disiapkan pada langkah 6. JANGAN Campurkan 2
reagen sebelum pewarnaan, tuangkan bersama langsung di atas gel.
⬢ PERHATIAN Reagen ini bersifat kaustik dan akan meninggalkan noda yang tak
terhapuskan – GUNAKAN SARUNG TANGAN!
⬢ Saat pita akromatis mulai terbentuk pada durasi sekitar 5 - 15 menit, buang noda dan bilas
secara ekstensif dengan ddH2O.
⬢ Pita akromatik mendemonstrasikan keberadaan aktivitas GPx. Gambar seperti SOD gel

15
Terima Kasih
16