Anda di halaman 1dari 37

Rekayasa Metabolik

Escherichia coli untuk


Produksi Hyaluronic Acid
Dari Glukosa dan
Galaktosa

Anggota Kelompok :
Safira Prisya Dewi (21121008)
Alnadia Yusriya Hibatullah (21121011)
Agung Gunawan (21121039)
Jurnal Acuan
Daftar Isi

03
Hasil dan
01 Pendahuluan Pembahasan

02 Metode
04 Kesimpulan
01
Pendahuluan
Apa itu Hyaluronic acid?
polisakarida alami yang menyusun jaringan ikat. Fungsi
utama molekul ini adalah untuk menstabilkan struktur
interseluler (bagian dalam sel) dan membentuk matriks
fluida untuk lokasi pengikatan kolagen dan serat elastik.

Joseph A. Mauriello (2004)

Inci, I. (2021). Preparation and


characterization of decellularized rooster
Pawitan, J. A. (2020). Kelainan Matriks
comb as a scaffold for tissue engineering
applications. Tissue and Cell, 73, 101614. Ekstraseluler Agrekan pada Osteoarthritis.
Hyaluronic acid digunakan untuk apa
saja?

de Oliveira, et. al., 2019


Produksi Hyaluronic acid dari Rekayasa Metabolik
E. coli
02
Metode
Strain dan Kondisi Kultur
Strain yang digunakan sebagai inang produksi Hyaluronic acid (E.coli strain K12 W3110)
Strain dan Kondisi Kultur
Komposisi Jumlah (satuan)

Yeast extract 5 gram

Pepton 10 gram

NaCl 10 gram/L

Ampicilin 50 μg/mL

Kanamycin 25 μg/mL

E. coli strain K12 Chloramphenicol 17.5 μg/mL


W3110 dikultur
dalam media Luria Isopropil -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; Georgiachem,
Bertani USA) digunakan pada konsentrasi akhir 1mM untuk induksi
ekspresi gen bila diindikasikan.
Strain dan Kondisi Kultur

5 ml

Kultur E. coli Media LB 100 mL + Kultur dishaker inkubator dengan


(Glukosa 3 gr/L dan kecepatan 200 rpm dan pada suhu
Galaktosa 3 gr/L 37oC
Konstruksi dari Mutan Knockout
Gen galR, galS, zwf, dan pfkA di knock out dengan modifikasi metode one-step inactivation

1 2 3

Preparasi fragmen Transformasi E.coli dengan Transformasi sel


DNA linear plasmid pCW611 dan kompeten E.coli dengan
preparasi sel kompeten fragmen DNA linear
Konstruksi dari Mutan Knockout
Preparasi fragmen DNA linear dengan two-step polymerase chain reaction (PCR)

Template Plasmid :
galR
plasmid pMtrc9 yang memiliki lox66-cat-lox71 cassette.

galR galR
Primer :
galR-KO-F1, galR-KO-R1, galR-KO-F2, dan galR-KO-R2

= lox 66 dan
galR lox71
Zhao, Can & Dineen, Lauren & Lebedinec, Ressa.
(2019). High‐Throughput Gene Replacement in
Aspergillus fumigatus. Current protocols in
microbiology. 54. 10.1002/cpmc.88.
Kim JM, Lee KH, Lee SY. (2008). Development of a
markerless gene knock-out system for Mannheimia
succiniciproducens using a temperature-sensitive
plasmid. FEMS Microbiol Lett. 2008 Jan;278(1):78-
85. doi: 10.1111/j.1574-6968.2007.00981.x.
Konstruksi dari Mutan Knockout
Preparasi Sel Kompeten E.coli dengan plasmid pCW611

1 2 3 4

1 ml
kultur sel

E.coli dengan
plasmid pCW611 Medium LB + 100 ml medium LB + ampicillin +

ampicillin
10 mM arabinosa Preparasi sel elektro
arabinosa untuk induksi promoter kompeten dengan
Inkubasi suhu 30℃ PBAD (λ-Red recombinase) metode Sambrook et al.
selama 12 jam Inkubasi suhu 30℃ (1989)
Konstruksi dari Mutan Knockout
Transformasi fragmen DNA linear ke dalam sel E.coli kompeten

1 Electrik
shock
2 3 4

Fragmen DNA Inkubasi suhu 30℃ LB agar yang


linear untuk knock Sel E.coli selama 1 jam
kompeten mengandung
out GOI chloramphenicol
Konstruksi dari Mutan Knockout
Skrining Sel Rekombinan E.coli

1 2 3
Koloni
terkonfirmasi

Sel E.coli LB agar yang +


Screening dengan
rekombinan chloramphenicol +
metode PCR
ampicillin
menggunakan primer
knockout
Konstruksi dari Mutan Knockout
Ekspresi Gen cat dari Kromosom

1 2 3 4 5

Pemanasan
pada suhu
42℃
1 ml medium LB agar + Screening dengan
Sel E.coli LB broth ampicillin + IPTG metode PCR
rekombinan menggunakan primer
IPTG untuk induksi
promoter lacUV5 (Cre- knockout
recombinase)
Konstruksi Gen dan Kluster Gen

1 2 3

1.Plasmid pTrc99a-galU-ugd
2.Plasmid pTrc99A-glmSU-glmM
Inkubasi pada 50℃
3.Plasmid pTac15k-hasA
15 µl assembly mixture selama 60 menit
Gen galU, ugd, dan 5 µl larutan DNA
glmSU, glmM, dan berisi plasmid restriksi Menghasilkan plasmid rekombinan
HasA diamplifikasi dan DNA fragmen pTrc99a-galU-ugd, pTrc99a-glmUS-
dengan PCR glmM, dan pTac15k-hasA
Purifikasi Hyaluronic Acid

1 2 3 4 5

Pellet dilarutkan
dalam 1 ml larutan
0.15 M NaCl

1 ml 0.1% SDS +
1 ml cell broth Sentrifugasi Supernatan + 3 ml Sentrifugasi 5.000
13.000 rpm, 4℃, etanol, inkubasi rpm, 4℃, 20
Inkubasi suhu 10 menit overnight pada 4℃ menit
ruang selama 10
menit
Kuantifikasi Hyaluronic Acid
Turbidimetric method dengan cetyl trimethylammonium bromide (CTAB)

1 2
500 µL 0.2 M sodium 1 ml CTAB (pre- 3
acetate wormed di 37℃)

500 µL sampel
HA yang
terpurifikasi

CTAB = zat pendeteksi HA Perhitungan OD


Inkubasi 10 menit
pada 600 nm
di 37℃
Perhitungan Berat Molekul HA

Sampel HA yang
terpurifikasi

Gel permeation chromatograph


Metode Analisis: DCW
Pertumbuhan sel dihitung dengan dry cell weight (DCW)

5 ml
1 2 3

Kultur E. coli Sentrifugasi 13000 Didapatkan gDWC


rpm, 5 menit per L
Metode Analisis: HPLC
Pengukuran konsentrasi glukosa dan galaktosa

Refractive index
MetaCarb 87H detector
column

Mobile phase 0.01


N H2SO4, 25℃,
flow rate 0.5
ml/min
03 Hasil dan Pembahasan

VISIT SLIDESGO.COM
Pathway Metabolik E. coli

Meliputi 3 Pathway
secara garis besar
yakni :
1. Leloir Pathway,
2. Entner-Doudoroff
Pathway, dan
3. Pentose Phosphate
Pathway
Ekspresi Heterolog dari Streptococcus zooepidemicus Hyaluronic Acid
Sintase dalam Escherichia coli

untuk membangun galur


basal baru untuk
produksi asam
hialuronat, gen hasA dari
Streptococcus
zooepidemicus ATCC
35246 di bawah kendali
tac
promotor pada plasmid
pTac15k di E. coli K12
W3110. Strain yang
diperoleh diberi nama
HA01.
Uptake Galaktosa Lemah dengan Knocking-Out galR dan galS Tidak
Cukup untuk Menghasilkan Hyaluronic Acid

HA02

galR dan galS


mengkodekan
DNA-binding
transcriptional
repressor dan
isorepressor
Uptake Galaktosa Lemah dengan Knocking-Out galR dan galS Tidak
Cukup untuk Menghasilkan Hyaluronic Acid

Ekspresi dari hyaluronic acid


synthase terdeteksi lewat SDS-
PAGE

HA01 (A), HA02 (B).


Simbol menunjukkan : Hal ini disebabkan karena prekursor untuk
glukosa (persegi),
galaktosa (bulat), and produksi hyaluronic acid pada strain ini
gram dry cell weight kurang
(segitiga).
Peningkatan Konsumsi Galaktosa dan Pengurangan Uptake Glukosa
Setelah Knockout Gen Kunci dalam Jalur EMP dan PP

Untuk mereduksi konsumsi


HA03
glukosa melalui jalur EMP
dan PP
Peningkatan Konsumsi Galaktosa dan Pengurangan Uptake Glukosa
Setelah Knockout Gen Kunci dalam Jalur EMP dan PP

HA02 (B), HA03 (C). Simbol


menunjukkan : glukosa
(persegi), galaktosa (bulat),
and gram dry cell weight
(segitiga).
Penguatan Biosintesis UDP-N-Acetyl Glucosamine
1 Menguatkan prekursor UDP-N-acetyl 2 Meningkatkan pembentukan UDP-
glucosamine glucuronic acid

Overekspresi gen glmS, glmM, dan


glmU pada strain HA03

Plasmid pTrc99a-glmSU-glmM

Strain HA03GlcNAc
● Laju konsumsi galaktosa
HA03 dengan
HA03GlcNAc tidak
berbeda signifikan

● Laju konsumsi glukosa


oleh HA03GlcNAc lebih
rendah dibanding HA03
Hyaluronic acid ● Knock out gen pfkA dan
Produksi HA oleh
HA03GlcNAc sebesar 21.52 ↑ 2.59 kali zwf -> proses
katabolisme glukosa
mg/l tidak dilanjutkan ke jalur
EMP dan PP

Strain HA03GlcNAc
Penguatan Biosintesis UDP-Glucuronic Acid

2 Meningkatkan pembentukan UDP-glucuronic acid

1. Overekspresi gen galU dan


ugd pada strain HA03
2. Aktivasi jalur galaktosa
(Leloir Pathway)

Strain HA03GlcA
Hyaluronic acid
Produksi HA oleh
HA03GlcNAc sebesar 29.98 ↑ 3.61 kali dari strain HA03

mg/l

Strain HA03GlcA
Kesimpulan
1. E.coli strain HA01 tidak menunjukkan konsumsi galaktosa dan produksi hyaluronic acid tidak
terdeteksi.
2. E.coli strain HA02 menunjukkan konsumsi galaktosa yang lemah namun produksi hyaluronic acid
tidak terdeteksi.
3. E.coli strain HA03 menunjukkan penurunan laju konsumsi glukosa, peningkatan laju konsumsi
galaktosa dan produksi hyaluronic acid.
4. E. coli strain HA03GlcNAc menunjukkan penurunan laju konsumsi glukosa, peningkatan laju galaktosa
namun tidak signifikan dengan strain HA03, dan produksi hyaluronic acid lebih tinggi dibanding strain
HA03
5. E. coli strain HA03Glca menunjukkan penurunan laju konsumsi glukosa, peningkatan laju galaktosa
lebih tinggi dibanding HA03GlcNAc, dan produksi hyaluronic acid lebih tinggi dibanding strain
HA03GlcNAc
Daftar Pustaka
Jurnal Utama :
Woo JE, Seong HJ, Lee SY and Jang Y-S. (2019). Metabolic Engineering of Escherichia coli for the
Production of Hyaluronic Acid From Glucose and Galactose. Front. Bioeng. Biotechnol. 7:351. doi:
10.3389/fbioe.2019.00351

Jurnal Pendukung :
Kim, J. M., Lee, K. H., & Lee, S. Y. (2008). Development of a markerless gene knock-out system for
Mannheimia succiniciproducens using a temperature-sensitive plasmid. FEMS Microbiology
Letters, 278(1), 78–85. doi:10.1111/j.1574-6968.2007.00981.x
Pan, Rongqing & Zhang, Ji & Shen, Wei-Liang & Tao, Zheng-Qing & Li, Shun-Peng & Yan, Xin.
(2011). Sequential deletion of Pichia pastoris genes by a self-excisable cassette. FEMS yeast
research. 11. 292-8. 10.1111/j.1567-1364.2011.00716.x.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Terima
Kasih

Anda mungkin juga menyukai