Penggunaan Bioactive PROTEIN/PEPTIDA

Untuk menghasilkan scaffold yang aktif , ditambahkan:

1.GROWTH FACTORs/CYTOKINEs/ CHEMOKINEs
- Menginduksi adhesi, proliferasi dan differensiasi dari
stem/progenitor cells menghasilkan sel lini tertentu, sehingga
meregenerasi jaringan tertentu yang diinginkan
- Meningkatkan vaskularisasi pada scaffolds (angiogenesis)

2.CELL ADHESION SEQUENCEs/LIGANDs

- Berperan pada adhesi sel/substrat yang memimick ECM komponen
untuk mengontrol distribusi sel spesifik pada scaffold

3.TRANSCRIPTIONAL FACTORS
- Berperan sebagai transcriptional effectors yang mengatur respon
selular (proliferasi, differensiasi, dan cellular patterning)
 Growth Factors/Cytokines
 Growth factors/cytokines merupakan protein/peptida
bioactive (10-50 kDa), yang mentransmisi sinyal ke nucleus
setelah berinteraksi dengan receptor transmembran.

 Diketahui ratusan GFs/sitokine tetapi hanya beberapa yang digunakan

dalam rekayasa jaringan
 MEKANISME KERJA GF
 GFs di sekresikan sebagai protein terlarut yang bekerja pada sel
produsen tsb (autocrine), sel bertetangga (paracrine), atau terikat
pada membran dan berinteraksi dengan receptor pada sel
sebelahnya (juxtacrine).

Trans-signalling
 Tranduksi sinyal oleh BMP receptor.

BMP-menginduksi
pembentukan komplek
heteromeric dari
BMPRI & BMPRII 
BMPR II serine/
threonine kinase aktif
 fosforilasi receptor
BMPRI pada GS-
domain.

ATF-2, activating transcription facter-2; ELK1, ETS-like protein-1; ERK,

extracellular regulated kinase; JNK, c-jun N-terminal kinase; TAB, TAK-1 binding
protein; TAK, TGF- activated kinase; XIAP, X-linked inhibitor of apoptosis protein.
 Pada umumnya, GFs mempunyai efek berbeda pada sel
berbeda (pluripotent)

Pentingnya regulasi dan lokalisasi ketat dari GFs

 BMPs dapat mempengaruhi

beberapa tingkat diferensiasi
dari mesenchymal cells in vitro.

Id = inhibitor of
differentiation
 ANGIOGENESIS
 Invasi pembuluh darah pada scaffolds sangat penting untuk
ketahanan hidup sel dan regenerasi jaringan tervaskularisasi.
 Pembuluh darah dibentuk melalui proses angiogenesis, yang diatur
oleh pro- & anti-angiogenic GFs.

 Pro-Angiogenic GF:
FGF, VEGF, angiopoietin 2
 Anti-Angiogenic GF:
PDGF, TGF-, ang-1

Pelepasan ganda/DUAL
release pro- & anti-
angiogenic GFs
 Ikatan VEGF pada
VEGFR

Positif & negatif VEGFR

pada patogenesis
 GF UNTUK REGENERASI TULANG

GF Aktivitas terkait
TGF- Prolif & differentiation sel osteoblasts

BMP Differentiation sel pembentuk tulang

IGF-1 Prolif sel osteoblasts, sintesis ECM

FGF-2, PDGF Prolif sel osteoblasts

 GASTRIC ULCER HEALING

Healing zone: suplai sel untuk pertumbuhan struktur glandular

 GASTRIC ULCER HEALING
 Selama penyembuhan luka, ekspresi gen Gf diatur secara
ketat pada urutan waktu tertentu .
 EGF, FGF, VEGF, PDGF terutama berkontribusi pada
proses penyembuhan luka

Penghantaran EGF secara

lokal dapat menstimulasi
regenerasi pada pasien yang
mengalami short bowel
syndrome
 WOUND HEALING

GF YANG DIGUNAKAN PADA WOUND

HEALING
GF Relevant Activities
PDGF Aktif pada semua tahap penyembuhan
luka
EGF Mitogenik untuk keratinocytes

TGF-  migrasi Keratinocytes, sintesis ECM,

diff. Sel ephitelial
FGF stimulan umum untuk wound healing
WOUND HEALING
 WOUND HEALING
INTEGRA skin grafting (FDA approved):
Bovine collagen and chondroitin-6-sulfate from shark cartilage, with
an outer silicone covering (min. evaporation) = an organotypic dermis
for skin grafting = the acellular composite recruited host dermal
fibroblasts and was degraded during cell invasion.  The silicone
sheet was removed 2–3 weeks after placement

Transcyte (Dermagraft-TC) (FDA approved):

an inner nylon mesh in which human foreskin fibroblasts were embedded
and an outer silicone layer to limit evaporation = temporary wound
coverage after excision of the eschar from burn wounds
 REGENERASI MYOCARDIAL
 Tidak seperti katup jantung atau pembuluh darah, otot jantung
mempunyai potensi untuk regenerasi rendah.

 Sel pembentuk otot (Myocytes) ditanam pada scaffold alginat dapat

menginduksi pembentukan otot cardial secara in vitro, tetapi dengan
ketahanan hidup/ engraftment in vivo terbatas.

 scaffold alginate yang ditambahkan GF diberikan secara catheter-

based dapat menstimulasi regenerasi otot jantung in vivo.
GFs yang dapat digunakan untuk REGENERASI MYOCARDIAL:

GFS ACTIVITY
Granulocyte colony- Mobilisasi bone marrow stem cells,
stimulating factor proliferasi, differeniasi, dan ketahanan
(G-CSF) hidup myeloid progenitor cells

Erythropoietin (EPO) Untuk ketahanan hidup dan diferensiasi

erythrocyte
Stromal Derived GF Berperan penting dalam trafficking dan
survival sel hematopoietic, endothelial
(SDF-1)
progenitors dan mesenchymal stem cells.

IGF-1 meningkatkan nuclear phospho-Akt dan

telomerase dan menghambat aging dan
kematian sel cardiomyocyte
 REGENERASI HEPATIC

Pasien yang menderita kegagalan hepatic total yang

disebabkan oleh penyakit, komplikasi genetic atau
reaksi efek samping obat seperti Fulminant hepatic
failure (FHF) = membutuhkan transplantasi liver

Fungsi Liver :
1. Menghilangkan toxins
2. Menghasilkan aktivitas metabolik seperti cytochrome P-450,
penyimpanan glycogen, produksi urea,
3. Melepaskan protein, karbohidrat, lipid, dan membuang hasil
metabolisme
 REGENERASI HEPATIC
Liver terdiri dari sel parenchymal seperti:
 hepatocytes (60% dari populasi sel),
 hepatocyte precursor cells (oval cells or Ito cells),
 stellate cells, kuppfer cells, epithelial cells,
 sinusoidal epithelial cells,
 biliary epithelial cells, dan
 fibroblasts

Hepatocytes terutama menghasilkan fungsi hepatik, membuang

toxins dan sintesis proteins seperti albumin, alpha-fetoprotein (AFP),
dan transferrin
== banyak digunakan dalam riset rekayasa jaringan

Co-culture beberapa kombinsi sel ditujukan untuk menghasilkan hasil

interaksi yang diperlukan untuk pertumbuhan, fungsi, atau
diferensiasi sel.
 REGENERASI HEPATIC

GFs yang ditujukan untuk REGENERASI LIVER:

GFS ACTIVITY
HGF mediate growth, proliferation, angiogenesis
and cell motility

HGF, VEGF mediates angiogenesis

EGF, FGF, IL-6, IGF, play an important role in the trafficking and
TGF- survival of hematopoietic, endothelial
progenitors and mesenchymal stem cells.
 Recombinant growth factors/cytokines
 Many Gfs are physiologically in mixtures and in very low
concentration, therefore, the isolation from autologous
sources is not efficient.
 For tissue regeneration, GFs are generally required in higher
concentrations.
 Specific genes for the transcription of GFs have been elucidated.

Recombinant DNA technology for GF synthesis

 For example: over expression of recombinant human BMP-2 can be
conducted in Eschericia coli which then renaturated and isolated the
active form using heparin coloumn chromatography.
 Over expression of recombinant human VEGF can be conducted in
yeast which then isolated the active form using Nickel coloumn
chromatography.
 Cell adhesion peptides/Ligands
 LIGANDs are truncated version of ECM proteins ( a
few amino acids ˜ 1000Da) which are responsible for cell
adhesion
 LIGANDs used in tissue
engineering

 LIGANDs are generally

produced by solid phase
synthesis or recombinant
DNA technology

Tessmar & Gopferich, Adv. Drug Del

Rev 59:274-291
 Ligand immobilization
 Immobilization of ligands on the surface of scaffolds would
potentiate the activity of the loaded growth factor, which could
improve a specific cell adhesion/migration.

Integrin
GFR
 Application of ligands:
- For long term tissue
engineering applications
- As bioactive coating for
implants

 Immobilization methods:
- Interpenetrating polymer
network (IPN)
Adhesion assembly
Adhesion/ - Coating
migration Actin polimerization
 Transcription factors
 Transcription factors are a potent signaling proteins that regulates
proliferation, differentiation, and cellular patterning.

 For example: Sonic hedgehog (Shh)

signals cells through Ptc and Smo which
regulate the transcriptional levels of
Ptc & Gli fam. genes. It has strong
osteogenic potential
 Recombinant modified Sonic hedgehog
(mShh) molecule has been synthesized
using recombinant DNA technique
 Application mShh:
- Shh in alginate/coll matrix improved
regeneration of rabbit cranial defect
- Immobilized mShh, in conjunction with
soluble BMP-2 and BMP-4, enhanced
differentiation of BMSCs on adult rat
 Pentingnya controlled release dari GFs
1. GFs secara fisiologis disimpan dalam natural ECM, misalnya terikat
pada domain heparan sulfate dari proteoglycan dan dilepaskan bila
ada sinyal yang memerlukan pertumbuhan sel.

2. Selama pertumbuhan dan regenerasi jaringan, beberapa GFs

dilepaskan dari natural reservoir pada jumlah tertentu dan pada
waktu tertentu.

3. GFs terlarut mudah didegradasi oleh protease dengan waktu-paro

(half-life) dalam rentang 1 – 300 menit. Sedangkan, regenerasi
jaringan dapat terjadi selama beberapa minggu hingga beberapa
bulan.

Diperlukan polimer scaffolds sebagai Controlled

release systems-sistem penghantaran (DDS)
DDS TEKNOLOGI
 DDS untuk CR dan Lokalisasi GFs

 DDS, seperti microspheres, menggunakan polimer alam

atau sintetik dengan kecepatan degradasi tertentu dapat
digunakan untuk mengenkapsulasi GFs. Microspheres
dapat dimasukkan kedalam scaffold atau
ditransformasi/sintering menjadi scaffold

 Enkapsulasi GFs dalam porous scaffolds (freeze-dry,

CO2superkritik /Sc-CO2)
 MICROPARTICLE-BASED SCAFFOLD
 Campuran microparticles mengandung beberapa GFs
 Campuran microparticles dengan profil pelepasan berbeda
 GF Gradient
 Dapat dibuat menjadi bentuk yang diinginkan
 Injectable scaffold
C2C12 cell adhesion, C2C12 cell growth on PDLLA
proliferation, migration on scaffold
PDLLA scaffold

C2C12 cell differentiation on PDLLA scaffold

cultured in BMP-2 supplemented medium
 Enkapsulasi GF dalam PLA microparticles
•Poly (D,L-lactide) : emulsi-solvent evaporation
•EMULSIFICATION METHOD:
GF dalam larutan air (w1/o/w2) GF in Solid form (s/o/w)

GF terdenaturasi pada antarmuka w1- Menjaga aktivitas GFs karena tidak

O sehingga retensi aktivitas rendah ada air

Terjadi difusi w1 ke w2 selama solven Masalah: ukuran partikel dan agregasi

evaporasi sehingga enkapsulasi efisiensi GF
rendah
Solid dispersion of GF sebelum
emulsifikasi
S/O/W EMULSIFICATION –
SOLVENT EVAPORATION

GF Particles PEG 18500: cryo-protectant, amphiphilic, partition

coefficient in O higher than in water
S/O/W

Freeze drying Emulsification

Water Solid dispersion

 Dispersi GF pada fase-O (DCM) : homogenous colloid,

ukuran partikel 88.1  3.8 nm (ditentukan dengan
PCS)
 Zonal release dari GFs
 Untuk rekayasa 2 atau lebih jaringan pada antarmuka
secara simultan
 Untuk melokalisasi GFs pluripoten sehingga mencegah efek samping
pada jaringan non-target

Endogenous or
transplanted cells

GF-1 Tissue-1
(i.e cartilage)

GF-2 Tissue-2
(i.e bone)
¤ Keterbatasan tissue
engineering
menggunakan
hydrogel & metal BMP-2
dienkapsulasi
dalam
hydrogel

SINTERING CO2 BERTEKANAN

SINTERING PANAS

Porous Non-porous
microparticl microparticl
es es
 FUSI MIKROPARTIKEL : PEMANASAN DALAM OVEN
 Kedalam mikropartikel berpori ditambahkan pemlastis 5% PEG20000 agar
mempunyai kecepatan fusi sebanding mikropartikel tidak berpori
Rheoplus

2 10
8 A 2 1 10
8

G’1.8 1.8 0.9

tan 
Heat Pa Pa

1.6 1.6 0.8

7 7
10 10
1.4 1.4 0.7

TSWP-OSup 3
1.2 1.2 0.6
Tanpa PEG20000 PP25-SN6364; [d=

1
6
1 0.5 10
6 G' Stora
Stor
G' 10
tan() B tan() G'
tan() Dam

0.8 0.8 0.4

0.6 D 0.6 0.3

5 5
10 10
0.4
C 0.4 0.2

Dengan PEG20000 ? = G’
0.2 E 0.2 0.1 ? = tan 
4 4
0 10 0 0 10
0 20 40 60 80 °C 100 0 20
Temperature T Te
o
Temperature ( C) Anton Paar GmbH

A-B = the glass transition region (50-58oC)

B-C = the rubbery plateau (58-72oC)
C-D = the rubbery flow region (72-80oC)
E = the flow region (> 80oC)
 FUSI MIKROPARTIKEL : BEJANA CO2 BERTEKANAN

PLGA drops at 60oC

 Telah diketahui bahwa adsorpsi CO2 berfungsi
sebagai pemlastis polilaktida [Liu & Thomasco, J. of
Supercritical Fluids 39 (2007) 416–425]

CO2 untuk meningkatkan fusi

pada permukaan mikropartikel

 Bejana yang dialirkan gas CO2:

 tekanan 7 bar/100 psi/0,7 MPa
 dipanaskan dalam penangas air pada
55 – 60oC
 selama 1,5 jam
 MODIFIKASI PERMUKAAN HIDROGEL
Perbandingan antara RGD dan non-RGD alginate gel dan microcapsules.

(B) Biomimetic sel-hydrogel capsules

mengnaudng RGD dibandingkan non-
RGD capsules. Modifikasi RGD
memberikan sel adhesi spesifik.
(C) dan (D) RGD-modifikasi scaffold
memberikan stabilisasi mekanik dari
sistem sel-polimer. Tingkat
pengembangan/swelling RGD scaffold
lebih rendah dibandingkan non-RGD,
sehingga ketahanan terhadap kompresi
lebih tinggi
Gambaran makroskopik kulit buatan/artificial dermis setelah
diimplantasi selama 7 hari pada tikus yang diinduksi diabetic secara
genetik
a.menggunakan bFGF-diimpreknasi pada gelatin microspheres,
b.Menggunakan larutan bFGF dan
c.tanpa bFGF