Identification biochimique

des espèces
d’ Entérobactéries

Mme KAIDI A.
Recherche de l’utilisation du Glucose, saccharose et
lactose, production de gaz et H2S sur milieu Triple Sugar
Iron Agar (TSI)

Le test est surtout utilisé pour différencier entre les

différents groupes genres et espèces des Enterobacteriaceae
Le but de ce test est de mettre en évidence cinq caractères
:
•La fermentation du glucose,
•La fermentation du saccharose
•La fermentation du lactose
•La production de gaz
•La production de sulfure d’hydrogène (H2S) à partir du
thiosulfate dans un environnement acide

•La fermentation du glucose seul montrera un virage de la

couleur au jaune du culot
•Celle du saccharose et du lactose se manifestera par un
 1 : Milieu non inoculé
Triple Sugar Iron Agar (TSI 1) 2 : G+, S+, L+, Gaz+,
H2S- : Klebsiella

3 : G+, S+, L+, Gaz-,

H2S-
Yersinia enteocolitica
(18h)

4 : G+, S+, L+, Gaz-,

H2S-
Yersinia enteocolitica
(48h)

5 : G+, S+, L+, Gaz+,

H2S+
Citrobacter

6 : G+, S+, L+, H2S+,

Gaz-
Erysipelothrix
1 3 4 5 rhusiopathiae
2 6 Fermente faiblement le
Triple Sugar Iron Agar (TSI 2)

1 : Milieu non inoculé

2 : G+, S+, L+ (alcalinisation),

Gaz+,H2S+: Salmonella 18h

3 : G+, S+, L+, Gaz+, H2S+

Salmonella (48h)

4 : G+, S+, L+,(alcalinisation)

Gaz+, H2S+ : Proteus 18h

5 : G+, S+, L+, Gaz+, H2S+

Proteus (48h)

1 2 3 4 5
Triple Sugar Iron Agar (TSI 3)

1 : Milieu non inoculé

2 : Attaque des sucres par voie

oxydative (alcalinisation),
Pseudomonas fluorescens

3 : Alcalinisation : Alcaligenes

4 : Alcalinisation production d’H2S

Shewanella

1 2 3 4
Fermentation des Carbohydrates
avec production de gaz

Le but de cette recherche est la mise en

évidence de la fermentation d’un sucre
spécifique avec la production de gaz qui
est récupéré dans une cloche de Durham.
La fermentation du sucre aboutit à
l’acidification se traduisant par le virage
de l’indicateur de pH du bleu au jaune
Fermentation des Carbohydrates
avec production de gaz

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Escherichia coli

3 : Réaction négative Shigella

(Acidification Glucose)

1 2 3
Test de l’Oxydation-Fermentation

Le but de ce test est de mettre en évidence l’attaque du

sucre par voie fermentative ou oxydative
Deux tubes contenant le milieu Hugh et Leifson sont utilisés:
Ce milieu donne deux résultats : Le type respiratoire et la
Mobilité

Tube 1 : avec vaseline stérile

Tube 2 : sans vaseline

S’il y a oxydation, production d’acide dans le tube 2

S’il y a fermentation, production d’acide dans les tubes 1 et 2

Les bactéries aérobies peuvent transformer les peptones

en
ammoniaque, entraînant une alcalinité dans la partie
supérieure du tube 2 (bleue)
Test de l’Oxydation-Fermentation

1 : Milieu non inoculé

2 + 3 : Fermentation avec
gaz dans le tube fermé :
Escherichia coli Mob+

4 + 5 : Fermentation avec
gaz dans le tube fermé :
Klebsiella Mob-

1 2 3 4 5
Test de l’Oxydation-Fermentation

1 : Milieu non inoculé

2 + 3 : Oxydation
Pseudomonas fluorescens

4 + 5 : Réaction
négative avec
alcalinisation à la
surface du tube ouvert
Alcaligenes

1 2 3 4 5
Test de la mobilité

Le but de ce test est de déterminer si les bactéries sont

mobiles à une température donnée

Le milieu utilisé est semi solide : Mannitol Mobilité

Sur ce milieu on peut avoir deux résultats distincts :

• La mobilité
• La fermentation du mannitol

• La mobilité se caractérise par une migration des bactéries

de la piqûre centrale vers le reste du milieu entraînant ainsi
une turbidité

• La fermentation du mannitol se traduit par un virage de la

Test de la mobilité

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive : Shewanella

3 : Réaction négative :
Acinetobacter

4 : Réaction négative : Klebsiella

1 2 3 4
 Recherche de la Nitrate réductase

Ce test permet de déterminer si la bactérie réduit les nitrates

en nitrites ou en azote. Cette recherche peut être réalisée sur
les milieux :
Mannitol mobilité
Bouillon Nitrate
Après incubation, deux réactifs sont rajoutés NRI (acide
sulfanilique) et NRII (alpha naphtol).
Les nitrates ont été réduits en nitrites, il y a formation
de diazonium, donnant une coloration rouge au milieu
• Le nitrate n’a pas été réduit en nitrite, aucune coloration
n’est observée
• Le nitrate a été réduit mais a un stade encore plus avancé
(stade azote)
Une pincée de poudre de zinc est ajoutée ce qui lui permet
de réduire les nitrates du bouillon en nitrite aboutissant à
la formation du diazonium donc à la coloration rouge
Si la bactérie a réduit les nitrates en azote libre, aucun
changement de couleur ne sera observé
Recherche de la Nitrate réductase

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive :
Escherichia coli

3 : Réaction négative :
Acinetobacter

4 : Réaction négative après

addition de poudre de zinc
Acinetobacter

1 2 3
4
Recherche de l’uréase

Le but de la recherche est de

déterminer la présence d’une uréase
chez la bactérie.
•L’uréase scinde l’urée en ammoniaque
et oxyde carbonique sur mileux :
Urée-Indole
De Christensen
Recherche de l’uréase

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Proteus

3 : Réaction négative Salmonella

(Acidification Glucose)

1 2 3
Recherche de la production d’indole

•Ce test est utilisé pour déterminer la

production d’indole à partir du tryptophane

Le milieu utilisé :
Milieu Urée-Indole

Après incubation, quelques gouttes du

réactif de Kovacs sont ajoutées. La
formation d’un anneau rouge indique la
présence de l’indole
Recherche de la production d’indole

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Escherichia coli

3 : Réaction négative Salmonella

1 2 3
 Recherche des Décarboxylases

Ce test est utilisé pour mettre en évidence la décarboxylation d’un

acide aminé se traduisant par la formation d’un amine. Pour chaque
réaction il est nécessaire de prévoire un témoin. Le milieu utilisé est :

Moeller avec acide aminé (lysine, ornithine, arginine)

Moeller témoin (sans acide aminé)

Après ensemencement des tubes avec AA et tubes témoins, une

couche de vaseline stérile est ajoutée. Les résultats donnent :
•Tube AA Jaune et tube témoin jaune : Pas de décarboxylase
•Tube AA Violet et tube témoin jaune : Décarboxylase
•Tube AA violet et tube témoin violet
Recherche des Décarboxylases

1 : Milieu non inoculé

2 : Tube témoin : jaune

3 : Réaction positive LDC+

Salmonella

4 : Réaction positive LDC+

Klebsiella

5 : Réaction négative LDC-

Citrobacter

1 2 3 4 5
Hydrolyse de la gélatine

Ce test est utilisé pour la mise en évidence de

la présence de la gélatinase chez une bactérie.

Après incubation, la boite de pétri est inondée

d’acide sulpho-salycilique, une zone claire
apparaissant sur la raie d’ensemencement
indiquerait l’hydrolyse de la gélatine
 Hydrolyse de la gélatine
Aeromonas hydrophila sur gélose à la Réaction positive
gélatine avant innondation avec
l’acide sulphosalicylique
Recherche de la Béta-galactosidase

Le but de ce test est de déterminer la présence

de l’enzyme Béta-galactosidase à travers
l’utilisation du substrat
O-Nitrophényl-béta-D-galactopyranoside (ONPG)

L’ONPG est hydrolysé par l’enzyme en :

O-nitrophénol (jaune)
Galactose
Recherche de la Béta-galactosidase

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Citrobacter

3 : Réaction négative Salmonella

1 2 3
Test du Rouge de Méthyle

Ce test permet de démontrer si la bactérie

est capable de maintenir les acides issus de la
fermentation du glucose malgré la présence de
tampon dans le milieu Clarks et Lubbs

Après incubation, le réactif rouge de méthyle

est ajouté
Test du Rouge de Méthyle

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Salmonella

3 : Réaction négative Klebsiella

1 2 3
 Recherche de l’acétoïne (Voges-Proskauer)

Le but de ce test est de mettre en évidence la

production de l’acétyl-méthyl-carbinol (acétoïne) à
partir de la fermentation du glucose.

La recherche de l’acétoïne se fait sur milieu Clark

et Lubbs
Après incubation, deux réactifs sont additionnés :
• Alpha-naphtol (VPI)

• Hydroxyde de potassium (VPII)

La présence de l’acétoïne se traduit par un virage

Recherche de l’acétoïne (Voges-Proskauer)

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Klebsiella

3 : Réaction négative
Escherichia coli

1 2 3
 Recherche de l’utilisation du citrate

Le but de ce test est de déterminer la

croissance de la bactérie avec le citrate
comme seule source de carbone.
L’utilisation de ce substrat aboutit à
l’alcalinisation du milieu qui vire du vert au
bleu
Recherche de l’utilisation du citrate

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Klebsiella

3 : Réaction négative
Escherichia coli

1 2 3
 Hydrolyse de l’esculine

Ce test est utilisé pour déterminer l’hydrolyse d’un

glycoside Esculine en esculétine et glucose
L’esculétine réagit avec le citrate férrique contenu
dans la gélose à l’esculine formant un complexe
phénolique de couleur brune

.
Hydrolyse de l’esculine

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Enterococcus faecalis

1 2