Instituto Politcnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas Depto.

De Bioqumica Seminario de la Asignatura de Bioqumica General para la carrera de Qumico Frmaco Industrial

Practica No. 5.5 EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO Practica No. 5.6 INHIBICIN ENZIMTICA
Seccin I
Profesor:
SANTIAGO HERNANDEZ JUAN CARLOS

Practica No. 5.5

Efecto de la concentracin de sustrato
Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, pero stas muestran tambin un rango caracterstico que no se observa en las reacciones no enzimticas:

la saturacin con el sustrato.

Efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de reaccin

A una concentracin de sustrato baja, la velocidad inicial de la reaccin es casi proporcional a la concentracin del sustrato y la reaccin, por tanto, es aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo a medida que la concentracin de sustrato aumenta, la velocidad inicial de la reaccin disminuye y deja de ser aproximadamente proporcional a la concentracin del sustrato, en esta zona el orden de reaccin es mixto. Con un aumento posterior de la concentracin del sustrato, la velocidad de la reaccin llega a ser esencialmente independiente de la concentracin de sustrato y se aproxima asintticamente a una velocidad constante..

Orden 0 Mixta 1 orden

En este intervalo de concentraciones la reaccin es esencialmente de orden cero con respecto al sustrato, y se dice entonces que la enzima se halla saturada con sustrato

Objetivo
Observar el efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de la reaccin enzimtica y determinar la constante de Michaelis-Mendel por los mtodos conocidos.

Desarrollo
Preparar una serie de tubos de acuerdo a la siguiente tabla
Problema Tubo No. Sacarosa 0.35M (ml) Regulador de acetatos pH4.7(ml) Agua (ml) Preincubacin Enzima 10mg/ml (ml) Incubacin Inactivacin Desarrollo de color Dilucin 1ml de 3,5DNS + 0.5 de enzima 0.00 0.50 Testigo 1 1.00 0.50 1.50 0.10 0.50 2.40 2 0.25 0.50 2.25 3 0.35 0.50 2.15 4 0.50 0.50 2.00 5 1.00 0.50 1.50 6 1.50 0.50 1.00 7 2.00 0.50 0.50 8 2.50 0.50 0.00

5 min a temperatura ambiente 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

5 min a temperatura ambiente 1ml de 3,5-DNS a cada tubo 5 min a 92C (Bao Mara) Colocar en bao de hielo y diluir con 4ml de agua destilada en cada tubo Leer en espectrofotmetro a 540nm

Resultado
Testigo Absorbencia Azcar reductor (mmoles) Velocidad (UI) Concentracin de sustrato (moles/l = M)
1 0.9

1 0.12 9 2.18 0.21 8 0.01

2 0.285 3.9 0.39 0.025

3 0.587 5.21 0.521 0.035

4 0.598 7.33 0.733 0.050

5 0.628 7.66 0.766 0.10

6 0.636 7.74 0.774 0.150

7 0.743 8.92 0.892 0.200

8 0.744 8.93 0.893 0.25

0 0 0 0

0.8

Velocidad (UI)

0.7 0.6 0.5

0.4
0.3 0.2 0.1 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Concentracin de sustrato (moles/l = M)

5
1/[S] 100 40 28.5714 20 10 6.6666 5 4 1/Vo 4.5871 2.5641 1.9193 1.5797 1.3054 1.2121 1.1210 1.1198

4 3 1/Vo 2 1 0 -100 -50 -1 -2 0

y = 0.0367x + 0.9444 R = 0.9959

50

100

150

1/[S]

m= 0.0367 1/Vmax= 0.9444

Km= m(Vmax) Km =0.0367 x 1.0593

Km= 0.0388

Discusiones

Realizamos nuestra grfica de acuerdo a los datos obtenidos en la absorbencia, y observamos que una baja concentracin de sustrato la velocidad no varia, pero cuando empezamos a aumentar esta concentracin aumento radicalmente hasta llegar un equilibrio, donde la velocidad ya es independientemente de la concentracin del sustrato.

Esto lo podemos observar en nuestros tubos y la absorbencia obtenida en cada uno de ellos, al principio cuando no haba cambios radicales la concentracin no cambiaba mucho y cuando fue radical lo hiso hasta llegar a un equilibrio observndolo en nuestras grficas.

Conclusin

El aumento de la concentracin de sustrato produce un aumento rpido de la velocidad de reaccin, al seguir aumentando la concentracin de sustrato, la velocidad de reaccin comienza a disminuir y a altas concentraciones de sustrato no cambia la velocidad de reaccin, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados, impidiendo la formacin de mas producto, observando al final de la grfica un comportamiento lineal.

Practica No. 5.6

Efecto de Inhibidores
Aquellas molculas que se encargan de retardar o disminuir la velocidad de reaccin catalizada por una enzima se le conoce como:

Inhibidor!

Combinacin no covalente en la enzima libre y/o al complejo enzima sustrato

Combinacin covalente a un grupo de la enzima

Inhibidor Competitivo

Este tipo de inhibidores normal mente se parece al sustrato Pero difiere en que no es reactivo

Inhibidor No Competitivo
Este inhibidor se puede unir a la enzima e integrase el sustrato o unirse al complejo ES por lo que le favorece la formacin o no del complejo del complejo ES No se une al principio Activo!

Inhibidor Acompetitivo
Este tipo de inhibidor se une solamente a la formacin del complejo ES por lo que le favorece el aumento [S] para formar mayor complejo y unirse Tampoco se une al principio Activo!

Objetivo

Determinar el tipo de inhibicin producido por una sustancia (anilina) sobre la actividad de la invertasa

Desarrollo
Preparar una serie de tubos de acuerdo con la siguiente tabla con una solucin de inhibidor (anilina 1.6M)
Problema Tubo No. Sacarosa 0.35M (ml) Inhibidor en regulador de acetatos pH4.7(ml) Agua (ml) Preincubacin Enzima 10mg/ml (ml) Incubacin Inactivacin Desarrollo de color Dilucin 1ml de 3,5DNS + 0.5 de enzima 0.00 0.50 Testigo 1 1.00 0.50 1.50 0.10 0.50 2.40 2 0.25 0.50 2.25 3 0.35 0.50 2.15 4 0.50 0.50 2.00 5 1.00 0.50 1.50 6 1.50 0.50 1.00 7 2.00 0.50 0.50 8 2.50 0.50 0.00

5 min a temperatura ambiente 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

5 min a temperatura ambiente 1ml de 3,5-DNS a cada tubo 5 min a 92C (Bao Mara)

Colocar en bao de hielo y diluir con 4ml de agua destilada en cada tubo
Leer en espectrofotmetro a 540nm

Resultado
Absorbencia 0 0.323 0.496 0.627 0.624 0.829 0.997 1.125 1.191
3 2.5

SIN INHIBIDOR Azcar Reductor Velocidad [M] (UI) 0 0 6 0.648 10 0.998 13 1.262 13 1.256 17 1.670 20 2.010 23 2.268 24 2.402

Concentracin de sustrato (moles/L=M) 0 0,01 0,025 0,035 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25

Absorbencia 0 0.228 0.294 0.323 0.382 0.423 0.462 0.504 0.534

CON INHIBIDOR Azcar Velocid Concentracin Reductor ad de sustrato [M] (UI) (moles/L=M) 0 0 0 5 0.4562 0,01 6 0.5895 0,025 6 0.6481 0,035 8 0.7673 0,05 9 0.8501 0,1 9 0.9289 0,15 10 1.0137 0,2 11 1.0743 0,25

Velocidad (UI)

2 1.5 1 0.5 0 0 0.05 0.1 0.15 0.2 Concentracin de sustrato (moles/L=M 0.25 0.3 Sin Inhibidor Con Inhibidor

SIN INIBIDOR 1/S 1/Vo 100 1.543 40 1.002 28.571 0.792 20 0.796 10 0.599 6.667 0.498 5 0.441 4 0.416

CON INHIBIDOR 1/S 1/Vo 100 21.922 40 16.964 28.571 15.430 20 13.033 10 11.763 6.667 10.766 5 9.864 4 9.308

25 y = 0.1277x + 10.211 R = 0.9258 20

15 Velocidad (UI)

10

Sin Inhibidor Con inhibidor

5 y = 0.0114x + 0.4545 R = 0.9615 0 -5 20 40 60 80 100 120

0 -60 -40 -20

Concentracin de sustrato (moles/L=M

Sin inhibidor

Con inhibidor

Conclusin
El tipo de inhibicin de la anilina sobre la actividad de la invertasa es acompetitivo
Despus de poder determinar con que inhibidor trabajamos, podemos utilizarlo para determinar que afinidad tiene la enzima por cierto grupo qumico, si la inhibi totalmente, como esta conformado su sitio activo y determinar alguna va metablica que deseamos investigar.