Ingeniera Gentica

Es la tecnologa del control y transferencia de ADN de un organismo a otro, que posibilita la creacin de nuevas especies, la correccin de defectos genticos y la fabricacin de numerosos compuestos.

Se utiliza en una amplia variedad de experimentos biolgicos y las aplicaciones prcticas van desde la toma de huellas dactilares a produccin de protenas a gran escala. En la prctica, con el fin de amplificar cualquier secuencia en un organismo vivo, la secuencia a clonar tiene que estar vinculada a un origen de replicacin; que es una secuencia de ADN.

-Transfeccin: Se introduce la secuencia formada dentro de clulas. -Seleccin: Finalmente se seleccionan las clulas que han sido transfectadas con xito con el nuevo ADN. Inicialmente, el ADN de inters necesita ser aislado de un segmento de ADN de tamao adecuado. Posteriormente, se da el proceso de ligacin cuando el fragmento amplificado se inserta en un vector de clonacin: El vector se linealiza (ya que es circular),usando enzimas de restriccin y a continuacin se incuban en condiciones adecuadas el fragmento de ADN de vector con el inserto de enzima ADN Tras la ligacin del inters y el vector con la inters, se lisa. produce la transfeccin dentro de las clulas, para ello las clulas transfectadas son cultivadas; este proceso, es el proceso determinante, ya que es la parte en la que vemos si las clulas han sido transfectadas exitosamente o no. Tendremos que identificar por tanto las clulas transfectadas y las no transfectadas, existen vectores de clonacin modernos que incluyen marcadores de resistencia a los antibiticos con los que slo las clulas que han sido transfectadas pueden crecer. Hay otros vectores de clonacin que proporcionan color azul/ blanco cribado. De modo, que la investigacin de las colonias es necesaria para confirmar que

Clonacin de organismos de forma natural

La clonacin de un organismo es crear un nuevo organismo con la misma informacin gentica que una clula existente. Es un mtodo de reproduccin asexual, donde la fertilizacin no ocurre. En trminos generales, slo hay un progenitor involucrado. Esta forma de reproduccin es muy comn en organismos como las amebas y otros seres unicelulares, aunque la mayora de las plantas y hongos tambin se reproducen asexualmente. Tambin se incluye la obtencin de gemelos idnticos de manera natural. Se considera como una alteracin espontnea durante el desarrollo embrionario, ignorndose su causa, aunque existe una correlacin familiar estadsticamente significativa.

Gemelacin artificial
Este tipo de clonacin consiste en tomar un embrin de hasta 8 clulas y generar embriones idnticos preimplantatorios (se podran generar hasta 8 embriones idnticos, uno a partir de cada blastmera). Las blastmeras biopsiadas del embrin original se introducen individualmente o de dos en dos en una zona pelcida vaca (puede proceder de otro animal, pues despus el embrin sale de ella), o en una cubierta artificial (ZPA), y de cada uno se generan embriones idnticos al original (clones). En veterinaria se lleva haciendo ms de 30 aos (para preservar las razas puras y mantener los caracteres deseados de un determinado animal), sin embargo, al considerarse una clonacin, est totalmente prohibido en humanos. Si se legalizase esta tcnica, el rendimiento por ciclo de fecundacin in vitro (FIV) aumentara espectacularmente, pues se podran obtener muchos ms embriones y fcilmente; adems ya no sera necesario someter a las mujeres a tratamientos fuertes de estimulacin ovrica, pues a partir de un slo embrin podran obtener hasta 8 clones: se transfiere uno y los otros se congelaran, para poder ser transferidos aos despus o como reserva de seguridad, por si el hijo necesita clulas madre para el tratamiento de alguna enfermedad.

diagnstico prenatal
En algunas especies, como los equinos, se ha utilizado la separacin de blastmeros de embriones previos a su implantacin para efectuar estudios de diagnstico de enfermedades genticas. En ellos se ha determinado la viabilidad de los embriones analizados despus de su transferencia en hembras receptoras, encontrndose tasas de gestacin de 21%. La tcnica de separacin de los blastmeros implica la remocin de la zona pelcida, ya sea por mtodos qumicos, mecnicos o enzimticos, para posteriormente obtener los blastmeros mediante aspiracin, extrusin o disminucin de sus interacciones en soluciones libres de Ca2+ y Mg2+. En humanos la separacin y cultivo de blastmeros aislados tambin han sido utilizados en estudios de biopsias de embriones en diferentes etapas de segmentacin con la finalidad de dar alternativas a los estudios de diagnstico prenatal, evaluando a su vez el desarrollo embrionario in vitro con el propsito de que se seleccionen los mejores embriones capaces de desarrollarse en blastocistos y congelarlos mientras se evalan sus blastmeros

Clonacin reproductiva
Es la clonacin propiamente dicha, y se basa en la creacin de una copia genticamente idntica a una copia actual o anterior de un ser humano o animal. Es tcnicamente posible, pues se ha conseguido en animales, aunque tiene bajo rendimiento y conlleva ciertos riesgos, como por ejemplo, problemas epigenticos (sndrome LOS: el clon crece mucho ms, que el animal original) y de senescencia. Este tipo de clonacin est absolutamente prohibido en humanos, pues no tiene ningn sentido teraputico. En 1996, fue clonada la oveja Dolly. Fue el primer mamfero clonado a partir del ADN derivado de un adulta en vez de ser utilizado el ADN de un embrin. Pero aunque Dolly tenga una apariencia saludable, se cuestiona la posibilidad de que envejeciera antes que una oveja normal. Adems fueron necesarios 277 embriones para producir este nacimiento.

Clonacin Teraputica (o Androptica)

La Clonacin Teraputica s est legalizada actualmente, puesto que tiene fines mdicos, el tratamiento de enfermedades. Este tipo de clonacin consiste en fusionar el ncleo de una clula adulta (madre o diferenciada) y un ovocito enucleado para crear un embrin a partir del que se aslan clulas madre embrionarias compatibles con el futuro receptor del tejido. Las clulas madre se aslan de la masa celular interna del embrin clonado una vez alcanzado el estadio de blastocisto. Estas clulas madre poseen la misma dotacin gentica que el paciente del que se tom la clula adulta, por lo que expresar su misma dotacin antignica (protenas superficiales de reconocimiento), de forma que podremos evitar una reaccin inmunolgica de rechazo al trasplantarle el tejido obtenido a partir de ellas (se puede inducir la diferenciacin de estas clulas madre hasta el tipo celular deseado, para formar un tejido determinado). Una vez que se han extrado las clulas El objetivo de la investigacin de la clonacin humana nunca ha madre de la masa celular interna, se destruye el embrin sido el de clonar personas o crear bebs de reserva. La clonado. investigacin tiene como objetivo obtener clulas madre para curar enfermedades.

Clonacin de sustitucin
Un cuarto tipo de clonacin sera la llamada clonacin de sustitucin que sera una combinacin de la clonacin reproductiva y la clonacin teraputica. En este tipo de clonacin se producira la clonacin parcial de un tejido o una Clonacin de especies extintas y en trasplante. parte de un humano necesaria para realizar un peligro de

extincin

La clonacin de especies extintas, ha sido un sueo para muchos cientficos. Uno de los objetivos previstos para la clonacin fue el mamut lanudo, pero los intentos de extraer ADN de mamuts congelados no han tenido xito, aunque un equipo ruso-japons est trabajando en ello. luz a un gaur ( un En 2001, una vaca llamada Bessie dio a bisonte indio) clonado de Asia, una especie en peligro, pero el ternero muri despus de dos das. En 2003, un banteng (tipo de toro) fue clonado con xito, adems tambin fueron clonadas con xito tres fieras de frica a partir de embriones congelados.

stos xitos han dado esperanzas sobre la posibilidad de que otras especies extintas puedan ser clonadas. De cara a esta posibilidad; las muestras de tejidos del ltimo bucardo (cabra montesa) fueron congelados rpidamente tras su muerte.

Los investigadores tambin estn considerando la clonacin de especies en peligro de extincin como el panda gigante, el ocelote, y guepardos. En 2002, los genetistas en el Museo Australiano anunciaron que haban replicado el ADN del Tigre de Tasmania, extinto hace 65 aos con la reaccin en cadena de la polimerasa. Sin embargo en el ao 2005, tuvieron que parar el proyecto ya que las clulas no se haban conservado bien. Uno de los obstculos en el intento de clonar especies extintas es la necesidad de mantener el ADN en perfecto estado, muy bien conservado.

La propiedad de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN se utiliza para la reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls, para obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, amplificndolo para propsitos de investigacin. En los procesos de PCR se requiere la utilizacin de polimerasas termoestables, como la Taq DNA polimerasa, debido a que es necesario aplicar altas temperaturas para desnaturalizar la molcula de ADN.

-Es la amplificacin de DNA in vitro por medio de la polimerizacin en cadena de DNA utilizando un Termociclador. -El propsito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA. -Se realiza la amplificacin de un fragmento de DNA.

PCR Polymerase Chain Reaction

Termocicla dor
-La PCR se realiza en un Thermo Cycler (Termociclador ). -Es una mquina que calienta y enfra la reaccin en perodos cortos de tiempo.

El proceso de PCR incluye 3 pasos bsicos que se repiten 25 veces o ms

1. Desnaturalizacin: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla. -Tpicamente se usa una temperatura de 95C - 97C, por 15 a 40 segundos el tiempo depende del tamao del genoma2. Apareamiento o anneling: Los cebadores primers previamente diseados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares especficos por complementariedad de bases. Para esto, Extensin. 3. Polimerizacin ose baja la temperatura -ej.: 55C por 30 segundos-. La Una Polimerasa de DNA extiende los primers, en el espacio temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores comprendido entre ambos primers, y coloca dinucleotidos segn sea el caso. trifosfatados (dNTPs) de 5a 3 leyendo el DNA de 3a 5. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de a 70C por Se efecta DNA molde 1 minutos (puede variar segn sea

En

un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta es sensitiva a alta temperatura, por lo que haba que aadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

Se

reemplazo la enzima por la de la bacteria Thermus aquaticus conocida como Taq pol. La deteccin del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electrofortico.

Anlisis de la Muestra -En algunos casos,

los productos amplificados secuencias que son reconocidas por endonucleasas. -Hibridacin, Southern Blot.

poseen

Se puede amplificar directamente de:

-ADN genmico -cDNA (RT-PCR)

Aplicaciones

Deteccin de agentes infecciosos como: hepatitis B y C, papiloma virus, HIV, entre otros. Anlisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto, anlisis de fsiles. Mutagnesis dirigida (cambios en la informacin contenida a travs de primers con mutaciones). Investigacin forense. Pruebas de paternidad.

Ventajas del PCR

-A partir de una muestra pequea de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. -El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y anlisis. -Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto. Desventajas del PCR -Sus aplicaciones son mltiples: medicina forense, diagnsticos, anlisis prenatales, etc. -Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mnima secuencia de 20 40 pb. -Se necesitan primers especficos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. -La polimerizacin puede tener errores al sintetizar el ADN -Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)

- Se basan en el estudio de secuencias especficas del DNA o RNA, tanto para su identificacin como para su eventual cuantificacin. -Para realizarlas se parte de sondas que son secuencias de ADN o ARN, complementarias a aquellas que se quieren detectar. -La Hibridacin o Acoplamiento de la secuencia gnica diana y la sonda complementaria se puede reconocer con mtodos radiactivos y colorimtricos. En general, se utilizan sondas previamente marcadas con sustancias radiactivas o fluorescentes. Las tcnicas ms utilizadas son la: -Hibridacin por Disolucin. -Hibridacin por Filtracin. -Hibridacin in situ y sus variantes.

Tcnicas de Hibridacin Molecular

Hibridacin por Disolucin evaluar la asociacin de una molcula de un -Se utiliza para
cido Nucleico en la formacin de dobles cadenas de DNA, DNA-RNA o doble RNA. sta tcnica es muy sensible, pero slo sirve para cuantificar el contenido de un cido Nucleico especfico.

Hibridacin por Filtracin

Consiste en la desnaturalizacin del DNA o RNA, inmovilizndolo en un soporte inerte como la nitrocelulosa, para hibridarlo posteriormente con una sonda marcada y as facilitar su deteccin. stas tcnicas se conocen con los nombres de Southern blot y Northern blot y sirven para analizar las cadenas de DNA y RNA, respectivamente.

Hibridacin in situ (HIS) Consiste en utilizar una sonda marcada de DNA o RNA y unirla

al DNA o RNA de una preparacin histolgica o citolgica. Recientemente se ha optimizado la tcnica de Hibridacin in situ usando fluorescencia, lo que permite detectar alteraciones puntuales y anomalas cromosmicas tanto en interfase como en metafase, tras hacer crecer previamente las clulas in vitro. Con la caracterizacin del Cariotipo y los rasgos morfolgicos de los cromosomas se pueden detectar

-Southern blot
sta tcnica se basa en tratar el DNA con enzimas de restriccin y separar los fragmentos con electroforesis en un gel de agarosa. Para su realizacin se parte de DNA aislado del tejido en las mejores condiciones posibles. El DNA, tras cortarlo con enzimas de restriccin, se desnaturaliza para obtener fragmentos de cadena sencilla que se transfieren del gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa sobre el cual quedan inmovilizados. sta transferencia es necesaria para que pueda realizarse la reaccin de Hibridacin. El DNA queda atrapado en la nitrocelulosa y es entonces cuando se puede hibridar con la sonda radiactiva o colorimtrica. Cada secuencia complementaria da lugar a una banda marcada que adquiere una posicin determinada por el tamao del fragmento delDNA.la reaccin se puede detectar por autorradiografa, ya que las sondas se pueden marcar radiactivamente. sta tcnica se utiliza en reordenamientos de procesos linfoproliferativos para determinar clonalidad a partir de los genes de las inmunoglobulinas en los linfomas B o de los

Northern blot
La tcnica descrita para el Southern blot aplicada a RNA se denomina Northern blot. En este caso, para transferir RNA desde el gel de agarosa a un medio adecuado para la Hibridacin es necesario realizar algunas modificaciones, pero el fundamento es el mismo. El hecho de que el RNAse degrade fcilmente es una limitacin que obliga a que todas las manipulaciones haya que hacerlas de forma rpida y evitando el contacto de la muestra con ARNasas (por ej., las ARNasas presentes en las manos). Con esta tcnica se detecta amplificacin de expresin gnica, y es parcialmente Western blot cuantitativa. Las bases de sta tcnica son similares a las del Southern blot pero aplicadas a las protenas. Para ello se han de aislar las protenas del tejido o clulas a analizar, separarlas en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y transferirlas a un papel de filtro donde se realiza su deteccin de los antgenos son similares a la inmunohistoqumica, con el empleo de anticuerpos y de sistemas de deteccin colorimtricos (fosfatasa-alcalina, avidina-biotina), por quimioluminiscencia o radiactivos. Sin embargo, no todos los anticuerpos utilizados

Es importante resear que cada da se utilizan ms los mtodos basados en la quimioluminiscencia, que se centran en el estudio de un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa y la posterior reaccin con luminol y percido. La emisin de luz correspondiente se detecta en placas de autorradiografa con mayor sensibilidad. La gran ventaja de ste mtodo respecto a otros es que permite conocer el peso molecular de la protena en estudio y tiene mayor fiabilidad en cuanto a la deteccin exacta, aunque no aporta informacin sobre su localizacin en el contexto celular y tisular dela lesin. Electroforesis

Es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de stas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaos moleculares y carga elctrica dependiendo de la tcnica que se use. La tcnica clsica utiliza una tira recubierta de una sustancia porosa impregnada de un electrolito. Sus extremos se sumergen en dos depsitos independientes que contienen ambos al electrolito y estn unidos a los electrodos del generador de corriente. La muestra se deposita en forma de un pequeo trazo transversal en la tira. La distancia de migracin se mide en relacin un marcador interno. Las placas son

-La electroforesis de cidos nucleicos en geles de agarosa, permite separar fragmentos de DNA de diferente tamao. -Sin embargo, no se puede saber en cul de los fragmentos se encuentra el gen o la secuencia de DNA que se busca.

Hibridacin en Colonia
Por hibridacin en colonia, se puede identificar cules de las colonias recombinantes obtenidas, tiene clonado un fragmento de DNA en particular.