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Determinao de resduos de cloranfenicol em amostras de leite e mel industrializados utilizando a tnica de espectrometria de massas em tandem (CLAEEM/EM)

1.1 Quanto ao analito:

O composto de Clorafenicol (CAP), D (-) - treo 2,2 dicloro N [ hidroxi (hidroximetil) p nitrofenil]. Massa molar: 323,1325 g/mol. Frmula molecular: C11H12C2N2O5. O Clorafenicol um frmaco antibacteriano de toma oral, conhecido comercialente como Quemicetina ou Sintomicetina;
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1.2 Quanto ao uso:


Uso veterinrio e humano. Possui propriedades de combate a uma variedade de microorganismos aerbios e anaerbios.

1.3 Quanto ao tratamento:


Em humanos, o CAP tem seu uso limitado ao tratamento de:

Conjuntivite aguda; Meningite bacteriana; Febre tifide; Salmonelose.

1.4 Quanto aos efeitos colaterais:


Anemia plasmtica; Diarria; Nusea; Vmito; Inflamao nos lbios e na lngua.

1.5 Quanto as proibies do medicamento:


Comunidade europia:

Em 1994: uso em animais bovinos, sunos, camares, abelhas, etc. Em 1996: tolerncia zero como limite residual em tecido animal.
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Em 1997: inicia um programa de verificao de medicamentos veterinrios de todos os produtos de origem animal importados de pases em desenvolvimento;

Em 2001 e 2002 foram encontrados resduos do medicamento em produtos de origem bovina, mel e outros, ocasionando na proibio e comercializao dos mesmos.

1.6 Quanto tcnica analtica empregada:


A tcnica de CLAE EM/EM vem se destacando devido a sua alta especificidade analtica para muito baixos nveis de CAP em matrizes de alimentos, visto que as figuras de mrito so: alta detectabilidade, seletividade e gerao de resultados auto-confirmatrios.

1.7 Quanto ao uso e proibio do medicamento no Brasil:

Os antibiticos podem ser utilizados na agropecuria para combater doenas como mastite e metrite no perodo de lactao do gado. Estes compostos tambm so utilizados para a produo de mel para aumentar a produtividade a baixo custo.

Atualmente o Brasil vem ocupando posio de destaque na exportao de 'commodities' e por isso a preocupao com a qualidade dos mesmos de extrema importncia para a competio no mercado globalizado e segurana do consumidor.
A ANVISA, lanou, em 2003, o Programa Nacional de Anlise de Resduos de Medicamentos Veterinrios em Alimentos Expostos ao Consumo Humano (PAMVet).
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2.1 Materiais e Reagentes


Todos os reagentes em grau HPLC; Amostras processadas em tubos de polipropileno de 15,0 mL, 1,0 g de padro primrio do composto de CAP ( 98% de pureza ) da Supelco;

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gua purificada; Solventes orgnicos: acetonitrila, clorofrmio, metanol e acetato de etila; Acetato de amnio como aditivo de fase mvel e Hidrogenofosfato dissdico para extrao em fase slida.

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2.2 Preparo das solues


Soluo estoque de de 220 mg L-1 CAP em CH3CN. Solues entre 0,025 a 2,500 ng mL-1 em CH3OH/H2O (50% v/v), aps diluies de uma soluo intermediria de 100 ng mL-1 preparada em CH3OH/H2O (50% v/v). (Curva Analtica) Soluo padro de 100 ng mL-1 CAP em CH3OH/H2O (50% v/v) e 2,0 mmol L-1 de NH4CH3COO. (Caracterizao e otimizao) Soluo de Na2HPO4 0,50 mol L-1 e pH 6.

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2.3 Fortificao das amostras


As amostras de leite e mel, isentas do composto CAP e adquiridas no comrcio foram fortificadas em concentraes conhecidas do analito.

Amostras de leite: 0,050; 0,100 e 1,000 ng mL-1 . Amostras de mel: 0,200 g kg-1.

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2.4 Mtodo de extrao

Amostra de leite

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Amostra de mel

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2.5 Equipamentos
Cromatgrafo lquido de alta eficincia Agilent 1100 Series, equipado com bomba quartenria e amostrador automtico com capacidade de 100 frascos de injeo, acoplado a espectrmetro de massas triploquadrupolar API 4000TM operado no modo de ionizao TurboIonSpray e com bomba de infuso Harvard Apparatus.
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2.6 Condies de anlise do Sistema CLAE-EM/EM


Cromatografia lquida de alta eficincia A eluio foi realizada em coluna Inertsil ODS-3 de 3,0 m, 50,0 x 2,1 mm, sob uma temperatura de 25 C com gradiente: Incialmente com 50% (v/v) das fases A (soluo aquosa contendo 5,0 nmol L-1 de NH4CH3COO) e B (soluo 95/5 de CH3OH/H2O v/v contendo 5,0 nmol L-1 de NH4CH3COO),

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Com rampa linear para 90% da fase B em 5 min e permanecendo nesta composio por mais 5 min.(tempo total 10 min). Tempo de equilbrio da coluna foi de 4,5 min. Fluxo de fase movl foi mantido a 300 L min-1 e o volume de injeo foi de 20 L.

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Espectrometria de massas Foi operado no modo MRM com ionizao por electrospray, no modo de ons negativos a 600 C; A voltagem do capilar foi otimizada 4500 V, com potencial de orifcio de -60 V; Nitrognio foi usado como gs de coliso e gs de dessolvatao nas presses de 8,0 e 20,0 psi. Ar sinttico ultrapuro empregado como gs nebulizante e como gs secante aquecido s presses de 35,0 e 40,0 psi.

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Otimizao do espectrmetro de massas

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Curva analtica

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Estudo de recuperao

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Limite de deteco e quantificao

A tcnica apresentou alta sensibilidade, onde o Limite de Deteco (LD) foi de 0,520 ng mL-1 e o Limite de Quantificao (LQ) de 1,850 ng mL-1.

Avaliao de amostras comerciais

Os resultados mostraram que a tcnica de CLAE-EM/EM uma ferramenta analtica de alta especificidade, detectabilidade e auto-confirmatria na determinao dos analitos em matrizes de alimentos. A metodologia analtica de determinao de CAP foi aplicada avaliao de amostras comerciais de leite e mel nacionais, com o intuito de verificar uma possvel utilizao deste composto na pecuria e na apicultura. Estes resultados mostram a necessidade de programas de monitoramento de resduos de medicamentos veterinrios em alimentos, o que imprescindvel para garantir a qualidade dos mesmos e, conseqentemente, a sade dos consumidores.