ALEXIS CARREL (inizio anni 60):

Le cellule sono entit immortali; la loro morte un evento patologico legato a grossolane perturbazioni dellomeostasi. LEONARD HAYFLICK: Le cellule invecchiano e muoiono fisiologicamente. J. KERR (65):

Descrisse un nuovo tipo di morte cellulare con caratteristiche diverse da quelle della necrosi, che defin con il termine APOPTOSI (dal greco: caduta delle foglie dagli alberi o dei petali dai fiori).

NECROSI es. ischemia /ipossia Riduzione fosforilazione ossidativa Riduzione attivit pompa sodica di membrana ATPdipendente Rigonfiamento cellulare

Metabolismo cellulare energetico alterato e riduzione del pH intracellulare

Esaurimento dei depositi di glicogeno

NECROSI es. ischemia /ipossia

Aumento della concentrazione intracellulare di Calcio

Attivazione di enzimi quali, fosfolipasi, proteasi, endonucleasi, con conseguente diminuzione di fofolipidi, distruzione delle proteine, danno alla cromatina

Differenze tra necrosi e apoptosi

CARIOLISI

CARIORESSI

Fasi dellapoptosi: 1. Disgregazione del nucleolo 2. Taglio lamina 3. Condensazione e taglio della cromatina in frammenti di 180-200 paia di basi 4. Migrazione dei granuli compatti di cromatina degradata verso la periferia del nucleo e verso la membrana plasmatica dove vengono circondati da evaginazioni della membrana che conferiscono alla cellula un aspetto a bolla (blebbing) 5. Le blebs si staccano dal corpo cellulare trascinando con s citoplama e materiale cellulare-corpi apoptoticifagocitosi Durata del processo: 1-2 hr

APOPTOSI E un processo fisiologico di eliminazione delle cellule danneggiate, invecchiate, potenzialmente dannose per larchitettura dellintero tessutoorgano o cellule non pi utili allorganismo.

Le cellule degli organismi pluricellulari non esprimono tutti i geni in loro possesso, ma attivano di volta in volta pacchetti di geni specifici, cui corrispondono specifici programmi cellulari: la morte per apoptosi rappresenta uno di questi programmi, alla pari del differenziamento e della divisione cellulare e comporta, come gli altri programmi, una complessa rete di segnalazione intercellulare e un processo decisionale interno alla cellula stessa, nel quale vengono soppesate le varie opzioni presentate dai segnali che giungono alla cellula.

Lapoptosi molto importante nell: EMBRIOGENESI INVOLUZIONE ORMONO-DIPENDENTE OMEOSTASI CELLULARE IMMUNITA CELLULO-MEDIATA

INVOLUZIONE ORMONO-DIPENDENTE

distruzione cellule endometriali durante il ciclo mestruale

Atresia dei follicoli ovarici nella menopausa

Regressione della mammella dopo lo svezzamento

IL PROGRAMMA APOPTOTICO SI AVVALE DI MOLECOLE SPECIFICHE, I CUI GENI SONO ALTAMENTE CONSERVATI

The model organism

S. Brenner riusc ad indurre mutazioni di specifici geni del genoma di C.elegans utilizzando EMS (etil metano sulfonato). Mutazioni a geni diversi determinavano effetti

specifici sullo sviluppo degli organi. La combinazione

dellanalisi genetica e losservazione delle divisioni cellulari al microscopio pose le basi alle scoperte successive.

Mapping the cell lineage

Identification of death genes

(ced

Caenorabdis elegans death)

ced - 3 Pro- apoptotici ced - 4

ced - 9

Anti-apoptotici

Brenner, Sulston, Horvitz

Nobel per la Fisiologia e Medicina 2002 Hanno dimostrato che lo sviluppo degli organi e la morte cellulare programmata sono regolati geneticamente. Essi hanno identificato i geni chiave che regolano la morte cellulare programmata in C.elegans e dimostrarono che i geni corrispondenti esistono anche negli animali superiori, incluso luomo. Come quasi sempre accade, levoluzione ha per complicato il meccanismo a mano a mano che si saliva verso organismi pi complessi, sostituendo a un gene prototipo tutta una famiglia di geni con propriet simili ma non del tutto sovrapponibili.

LE 3 FASI DELLAPOPTOSI:

Induzione
Esecuzione Riconoscimento e Fagocitosi

La cellula riceve di continuo informazioni (cross talk), segnali e stimoli che ne condizionano la sopravvivenza. Segnali di sopravvivenza e segnali di morte vengono integrati allinterno della cellula.

I diversi stimoli che sopraggiungono alla cellula sembrano seguire 2 distinte vie di segnalazione:
una attivata da segnali di morte che giungono a specifici recettori di superficie (VIA RECETTORIALE)

una attivata da segnali endogeni e regolata dal mitocondrio (VIA MITOCONDRIALE) Entrambe le vie convergono nellattivazione di proteasi specifiche dette CASPASI. Questo evento segna linizio della fase di esecuzione. Lattivazione delle caspasi determinato da un evento proteolitico e determina a sua volta unulteriore cascata di eventi proteolitici e nucleolitici preordinati, che amplificano il segnale e portano alle tipiche modificazioni morfologiche dellapoptosi. Tale fase richiede ATP.

APOPTOSOMA, Complesso di origine mitocondriale comprende:

un adattatore (APAF-1) una pro-caspasi iniziatrice (pro-caspasi 9) Una molecola di citocromo C Una molecola di ATP

Fas, ora classificato come CD95, una proteina di superficie appartenente alla superfamiglia dei recettori del TNF-NGF

DED

Fas, ora classificato come CD95, una proteina di superficie appartenente alla superfamiglia dei recettori del TNF-NGF

DED

INDUZIONE Ligando-Recettore-Adattatore-Procaspasi-Caspasi ESECUZIONE Caspasi (proteasi): Taglio del DNA Taglio proteine strutturali del nucleo Taglio proteine del citoscheletro

Prima per che le caspasi effettrici entrino in azione, rendendo irreversibile il cammino verso la morte cellulare, deve essere completata la fase di induzione, durante la quale vengono soppesati i segnali che giungono alla cellula. Infatti, una cellula riceve segnali di morte (per via recettoriale o endogeni), ma nel frattempo pu ricevere segnali di sopravvivenza veicolati da fattori di crescita, da citochine o da integrine e molecole di adesione.

3. MODULATORI
Mammiferi (anti-apoptotici) (pro-apototico) Bcl-2, BclxL Bax, Bad, Bak

Nel particolare gioco a scacchi che si gioca nella cellula (tra fattori pro- e anti-apoptotici), le due vie opposte schierano i propri pezzi sulla membrana esterna del mitocondrio. Alla fine, vinceranno i pi numerosi: la preponderanza di modulatori anti-apoptotici, manterr integra la membrana mitocondriale, mentre la preponderanza di modulatori pro-apoptotici determiner nel mitocondrio lapertura di megapori, che causeranno la caduta del potenziale mitocondriale e la fuoriuscita di sostanze pro-apoptotiche.

bcl-2
(B Cell Leukemia-2)

ced-9

E stato il primo gene dellapoptosi ad essere studiato nelluomo, isolato da una leucemia di tipo B

4. EFFETTORI
I complessi che si formano a livello dei domini recettoriali (e gli apoptosomi) operano dei tagli nelle pro-caspasi iniziatrici, che in tal modo si attivano. Si tratta di enzimi proteolitici (proteasi) il cui centro reattivo caratterizzato da una Cisteina e che tagliano i loro bersagli a valle di una breve sequenza di quattro aa, lultimo dei quali un residuo di acido Aspartico. I due spezzoni della molecola si uniscono a formare un dimero; le caspasi iniziatrici formano tetrameri (due molecole di caspasi, ciascuna costituita da due spezzoni) dopo aver perso una porzione regolatrice. Tipicamente, le caspasi iniziatrici (2,8,9,10) attivano le caspasi effettrici (3,6,7), ma possono anche essere attivate da queste ultime (amplificazione del segnale). Non tutte le caspasi sono coinvolte nellapoptosi; alcune svolgono altri compiti, come la caspasi 1 che regola lattivit dellinterleuchina 1 (una citochina proinfiammatoria).

VIA DI SEGNALAZIONE RECETTORIALE VIA DI SEGNALAZIONE MITOCONDRIALE

La fase di esecuzione sembra essere comune a tutte o quasi le vie dinnesco. A differenza del C. elegans, in cui presente la singola caspasi CED3, nelluomo sono state identificate almeno 10 di tali proteine.

Uno dei pi importanti bersagli delle caspasi effettrici ICAD, linibitore di CAD (Caspase Activated Dnase), unendonuclesi specifica dellapoptosi. Una volta liberatasi dallinibitore grazie allazione delle caspasi, CAD effettua tagli al doppio filamento nella regione internucleosomica della cromatina, rendendosi cos responsabile della frammentazione del DNA, tipica dellapoptosi. (Altre due nucleasi sono attive nellapoptosi: ENDO G e AIF, che fuoriescono dal mitocondrio insieme agli altri fattori pro-apototici). Il taglio proteolitico effettuato dalle caspasi attiva alcune molecole e ne inattiva altre: il fine quello di portare alla frammentazione della cellula mantenendone integra la membrana plasmatica. Verranno quindi inattivate le molecole coinvolte nella riparazione del DNA (es. PARP), mentre vengono attivate acinus (responsabile della condensazione della cromatina) e la trans-glutaminasi, una molecola che rende pi resistente la membrana cellulare.

5. INIBITORI (IAP)

Le caspasi non devono assolutamente attivarsi per eventi casuali, per cui sono di norma complessate con inibitori naturali, endogeni, che devono essere rimossi.

cytokine response modifier A (CrmA) protein inibisce la caspasi 8 e dunque protegge le cellule dallapoptosi attivata da CD95 o dal recettore di TNF
cellular FLICE-inhibitory protein (c-FLIP) capace di modulare lattivazione della pro-caspasi 8 e dunque previene lapoptosi mediata dai recettori di morte Heat Shock Proteins (HSP) proteggono la cellula dallapoptosi, legando molecole come il citocromo c, lAPAF-1 o le caspasi.

Smac/Diablo inattivano gli inibitori delle caspasi

6. INDUTTORI Appartengono alla categoria degli INDUTTORI un insieme eterogeneo di molecole, in grado di indurre apoptosi attraverso la via mitocondriale, determinando uno sbilanciamento tra modulatori antie pro-apoptotici a favore dei secondi.

reaper, hid e grim di Drosophila, sono induttori che si attivano in base a un orologio interno, ancora sconosciuto. Sembrano attivare il rilascio del citocromo c dal mitocondrio
p53, si attiva quando la cellula non riesce a compiere correttamente le tappe del ciclo cellulare a causa di danni al DNA. Se il danno persiste, p53 induce la sintesi di un modulatore pro-apoptotico, bax, che si localizza sulla membrana mitocondriale e favorisce lapertura dei megacanali.

Meccanismi di riconoscimento delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi.

Recettore delle asialoglicoproteine: sulle membrane di alcuni tipi cellulari (es. epatociti) durante il processo apoptotico vengono esposti alti livelli di glicoproteine desialilate che vengono riconosciute dalle cellule circostanti mediante il recettore delle asialoglicoproteine Recettore della vitronectina (VnR)/CD36: il sistema pi complesso e meglio caratterizzato, utilizzato dai macrofagi derivati dai monociti. Al sistema di riconoscimento partecipano tre molecole: i) Trombospondina: molecola trimerica, adesiva, prodotta e secreta dal macrofago, che funziona da "ponte molecolare" tra corpo apoptotico e complesso VnR/CD36; ii) VnR: presente sulle membrane del macrofago, un eterodimero che appartiene alla famiglia delle integrine, molecole di membrana implicate nelle funzioni di adesione e ancoraggio cellulare; iii) CD36: molecola di superficie, tipicamente espressa dai monociti, dai macrofagi e dalle piastrine, la cui funzione fisiologica non ancora ben determinata. Non ancora stata identificata la molecola riconosciuta sul corpo apoptotico da parte di questo complesso recettoriale. Recettore della fosfatidilserina (PS): normalmente i residui di PS sono situati sulla faccia citoplasmatica della membrana; nelle cellule apoptotiche l'asimmetria del foglietto lipidico viene persa in seguito all'attivazione di un enzima specifico ("scramblase") che trasloca i residui di PS sulla faccia esterna della membrana.

ALCUNE TECNICHE DI STUDIO DELLAPOPTOSI

Microscopia Elettronica

Microscopia Ottica a fluorescenza

Elettroforesi del DNA

TUNEL
KO dei geni dellapoptosi

LEUCEMIA LINFOCITICA

CARIORESSI

AUTOFAGIA o morte cellulare di tipo II

Il termine autofagia o autofagocitosi deriva dal greco e significa letteralmente mangiare se stessi. E un processo di auto-degradazione lisosoma-mediato. E considerata una risposta cellulare allo stress e viene attivata principalmente in due condizioni: quando necessario rimuovere componenti intracellulari alterate quando occorrono macromolecole essenziali e fonti di energia in carenza di elementi nutrizionali (stress da fame) Esistono tre tipi di autofagia: macrofagia, microfagia e autofagia chaperone-mediata.

Macrofagia: un organulo viene avvolto da una doppia membrana di derivazione del RE

Nella microfagia il lisosoma ingloba direttamente le regioni citoplasmatiche da degradare attraverso un complesso sistema di invaginazioni ed evaginazioni tubuliformi della propria membrana.

Nellautofagia mediata da chaperonine, proteine-bersaglio citosoliche recanti una specifica sequenza pentapeptidica vengono riconosciute e legate da unachaperonina citosolica, che le trasporta sulla membrana dei lisosomi

oltre 30 geni ATG sono stati trovati nel lievito e molti di loro sono ortologhi nei mammiferi per controllare i processi dinamici di autofagia

oltre 30 geni ATG sono stati trovati nel lievito e molti di loro sono ortologhi nei mammiferi per controllare i processi dinamici di autofagia quali: (i) induzione o inizio, regolata negativamente da mTOR (bersaglio della rapamicina mammiferi); (ii) nucleazione (formazione dellautofagosoma), che mediata dal complesso Beclin-1 (Atg-6) e Vps34(PI3K) (iii) allungamento, che un passo fondamentale nel formare il autofagosoma controllato da due sistemi di coniugazione (Atg12-Atg5 e LC3/Atg8) (iv) la maturazione, che prevede la fusione tra autofagosoma e lisosoma e degradazione del contenuto.

In Dictyostelium discoideum, unameba difettiva del macchinario apoptotico. In questo modello, lautofagia stata convincentemente dimostrata come meccanismo di morte cellulare in quanto una mutazione del gene ATG 1 diminuisce lautofagia e la morte cellulare per autofagia.

In Drosophila melanogaster stato dimostrato che la morte cellulare tessuto-specifica: es. durante lo sviluppo nellintestino si ha la morte cellulare per autofagia, mentre nelle cellule salivari per apoptosi

Nei mammiferi non c una chiara evidenza di morte cellulare per autofagia in condizioni fisiologiche In condizioni patologiche come ipossia/ischemia stata osservata morte cellulare per autofagia nel cervello di topi neonati ed adulti. La mancanza di ATG 7 nel SNC dei topi previene la morte neuronale indotta da ipossia/ischemia

Nei topi atg Knowckout si osserva un aumento di morte cellulare per apoptosi allo stadio embrionali suggerendo una funzione antiapoptotica per lautofagia

Nel riquadro in alto a sinistra si osserva una cellula sana, completamente distesa (il citoplasma colorato in verde) con il nucleo circolare (in giallo). La cellula apoptotica (freccia bianca), al contrario si presenta piccola con vescicole che emergono dai bordi. Il nucleo inoltre disomogeneo e frammentato in diversi corpuscoli (in arancione). Nel riquadro in basso invece sono rappresentate cellule in cui, in verde, marcata la proteina autofagica LC3. Nella cellula sana (a destra) la proteina si presenta dispersa in maniera omogenea nel citoplasma, nella cellula di sinistra invece il processo autofagico evidenziato dalla presenza di vescicole la cui formazione permessa proprio dalla proteina LC3.

APOPTOSI
Rapido collasso degli elementi del citoscheletro Preservazione degli organelli fino alla fase finale Assenza di infiammazione tissutale Attivazione della caspasi necessaria

AUTOFAGIA
Preservazione del citoscheletro fino alla fase finale Rapida eliminazione degli organelli

Assenza di infiammazione tissutale DNA frammentazione e attivazione caspasica solo nella fase ultima del processo

Morte cellulare per necrosi (A) e apoptosi (B e C). La cellula in figura C stata fagocitata da una cellula vicina