CROMATOGRAFA

Determinacin
Separacin
Historia
M. Tswett (1903)
Martin y Synge (1941)
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin en el
que los componentes de la muestra se distribuyen entre dos
fases, una de las cuales es fija o estacionaria y la otra
mvil.

La velocidad de desplazamiento es funcin del coeficiente de
distribucin de cada componente entre las dos fases.
] [A
] [A
= D
FM
FE
FE
slido
lquido
gel
FM
gas
lquido
fluido sc
Fundamento del proceso
cromatogrfico
Forma de realizar dicho
proceso
tipos de
cromatografas
tcnicas
cromatogrficas
la naturaleza de las fases mvil y
estacionaria y la clase de equilibrios
implicados en la transferencia de los
solutos entre las fases, es decir, el
mecanismo de interaccin


dispositivo utilizado para
conseguir el contacto entre la
fase mvil y la estacionaria
Proceso por el cual la FM atraviesa la columna
Eluyente columna eluato
Velocidad de flujo (mL/min)
volumen de disolvente que atraviesa la columna
por minuto
Velocidad de flujo lineal (cm/min)
longitud de columna atravesada por el disolvente
en un minuto
V
0

Representa fsicamente los espacios intersticiales
entre las partculas empaquetadas en la columna que
son accesibles a la FM, e incluye adems los
volmenes internos del sistema
Representacin grfica de la respuesta
del detector en funcin del tiempo,
volumen de eluyente o distancia en el
lecho cromatogrfico
funcionamiento del sistema
cromatogrfico
Informacin analtica
relativa a la muestra
el tiempo que tarda el mximo de un pico en
ser eluido despus de la inyeccin
intervalo de tiempo que transcurre desde que
el trazador es insertado al principio del lecho
cromatogrfico hasta que sale del mismo
t'
R
= t
R
- t
o

t
0

t
R

t
R

diferencia entre el tiempo de retencin del analito y el volumen muerto de la
columna, es decir, el tiempo que un analito es retenido en la columna
comparado con un compuesto no retenido
k' = ( t
R
- t
o
) / t
o

Es la relacin entre el tiempo
que las molculas del analito
estn en la fase estacionaria y
el que estn en la fase mvil.
t
R
= t
0
(1 + K')
K'= K
D

K'= D
m m
S S
V C
V C
FM la en pasa soluto el que tiempo
FE la en pasa soluto el que tiempo
K = =
P
es
y P
m
, probabilidades que tiene un analito de estar en la FE o FM,
respectivamente, coinciden con las fracciones del mismo en cada una de estas fases:
P
es
= K'/ 1+K'

P
m
= 1/ 1+K'
P
m
es equivalente al denominado factor de
retraso, R,
R = velocidad de desplazamiento del
analito/velocidad de FM = 1 / 1+K'

V= tF
K' = V'
R
/V'
0
V
R
= V'
R
+ V
0

volumen que ocupa en la columna la FM
V
0
= t
0
F
volumen de FM necesario para que se
produzca la elucin de un soluto

V
R
= t
R
F
V'
R
= t'
R
F
V
R
= V
0
(1 + K')

La longitud de una columna en la que el soluto experimenta
un equilibrio completo entre las dos fases
La eficacia de la columna aumenta cuanto mayor es el nmero de platos
tericos y menor la altura del mismo.
Eficacia de una separacin cromatogrfica
nmero de platos
tericos (N)
altura del plato
terico (H)

N = L/H

Una columna cromatogrfica es ms eficaz cuando menores son
los ensanchamientos de banda que origina
N = t
R
2
/o
t
2

N = 16 t
R
2
/ W
b
2

N = 4 t
R
2
/ W
i
2

= 5,54 t
R
2
/ W
h
2

|
.
|

\
|
+1,25
B
A
1
)
W
/
t
( 41,7
= N
2
0, R
velocidad finita a la cual el soluto alcanza el equilibrio
entre ambas fases
la forma resultante de la banda depende
velocidad de elucin
difusin del soluto a lo largo de la columna
existencia de diferentes caminos que las diversas
molculas de soluto pueden seguir cuando se mueven
entre partculas de la fase estacionaria.
estos efectos dependen de la velocidad con que la fase mvil
atraviesa la columna, y constituyen un mecanismo diferente de
ensanchamiento de banda cromatogrfica.
Ecuacin de van Deemter para la AEPT
H = A + B/u + Cu
A, B y C son ctes caractersticas de un
sistema dado:
coeficiente de difusin aparente
coeficiente de difusin longitudinal
coeficiente de transferencia de masa
Existe una velocidad ptima
para operar con cualquier
columna, a la cual la AEPT
alcanza un valor mnimo
H = B/u + C
S
u + C
M
u
H : cm
u: velocidad lineal de FM (cm/s)
B, C
S
, C
M
: ctes relacionadas con las
propiedades de la columna y del analito
Mecanismo diferente de
ensanchamiento de la banda
Define la capacidad de un sistema cromatogrfico para distinguir entre
dos componentes.
Es una funcin termodinmica que depende de las distribuciones relativas
entre las fases mvil y estacionaria.
Se expresa mediante el factor de selectividad o retencin relativa:
o
2,1
= t'
R,2
/ t'
R,1
= k'
2
/ k'
1

Para que una separacin sea posible, es necesario que los valores de Kde
los componentes de la mezcla sean diferentes.
Cuanto ms elevado es el valor de o , mayor es la selctividad de la FE, y
ms fciles las separaciones
Es un factor que se refiere a la capacidad de un sistema
cromatogrfico para separar dos sustancias, teniendo en cuenta no
slo la separacin entre picos, sino tambin los anchos de la banda
R
s
= 2(t
R,2
- t
R,1
) / (w
b,1
+ w
b,2
)
4
N
k
+ 1
k
1 -
=
R
2
2
s
o
o
Selectividad (o), se relaciona con los valores
de retencin relativa y mide el poder
discriminatorio del sistema cromatogrfico.
Retencin (k'), mide la fraccin de eluito
presente en la FE y expresa el poder de
retencin del sistema cromatogrfico.

Eficacia (N), mide la estrechez relativa de los
picos mediante el nmero de platos tericos
con que funciona la columna

modificar o y K: variando la temperatura o la composicin de las fases
cambiar N modificando la longitud de la columna, y H variando el caudal de fase mvil, el
tamao de partcula del relleno, la viscosidad de la fase mvil y el grosor de la pelcula de
lquido adsorbido que constituye la fase estacionaria.


Objetivo
conseguir picos bien definidos y separados en el menor tiempo
posible de anlisis
variando las condiciones experimentales:
velocidad de flujo,
tamao de partculas de soporte,
temperatura de la columna,
seleccin de fase mvil y estacionaria ms adecuada,
aumentando la longitud de la columna, etc
La ecuacin de la resolucin sirve de gua para elegir las condiciones que permitan
una buena separacin: o, K' y N pueden ajustarse ms o menos
independientemente.
Aumento del nmero de platos de la columna mejora la
resolucin:
longitud de la columna, temperatura, tipo de analito,
caudal, tamao de la muestra, tcnica de inyeccin,
etc.
El resultado es un estrechamiento de las bandas con el
consiguiente aumento de la altura de las mismas; el
tiempo de retencin prcticamente no se modifica.

disminuir el tamao de partcula del
relleno
reducir la viscosidad de la fase mvil
lquida
Un aumento de K' generalmente aumenta la
resolucin pero tambin el tiempo de elucin.
Intervalo ptimo de valores de K: 1 a 5.

Con fases mviles gaseosas, K' puede
mejorarse aumentando la temperatura
Con fases mviles lquidas, cambiando la
composicin del disolvente.


Un aumento en el factor de selectividad produce
un desplazamiento relativo de los mximos de las
bandas, con un rpido aumento de la resolucin.
Los procedimientos para aumentar o sin
modificar significativamente K' son, por orden
decreciente de conveniencia:
1. cambiar la composicin de la fase mvil incluyendo cambios en el pH (en
separaciones de cidos o bases ionizables)

2. cambiar la temperatura de la columna, muy til sobre todo en
cromatografa de cambio inico

3. cambiar la naturaleza de la fase estacionaria: disponer de varias columnas
fcilmente intercambiables

4. utilizar efectos qumicos especiales; incorporar a la fase estacionaria una
especia que forme complejos o interaccione de otra forma con uno o ms
componentes de la muestra.
Ejemplo: usar un adsorbente impregnado con una sal de plata mejora la
separacin de olefinas debido a la formacin de complejos entre los iones
plata y los compuestos orgnicos insaturados.



Cromatograma Dato de informacin cualitativa
t
R

Sustancia desconocida podemos
identificarla comparando su t
R
con el de un
patrn
dependen de una
variedad de
condiciones
experimentales
dividir la muestra en dos alcuotas: una de
ellas de cromatografa directamente,
mientras que a la otra se le adiciona una
cantidad dada de una sustancia patrn que
se sospecha existe en la muestra, y tambin
se cromatografa.
se obtiene conectando la lnea de base de
cada lado del pico por medio de una lnea
recta y midiendo la distancia perpendicular
entre esta lnea y el pico
precisin razonablemente grande
slo puede usarse cuando los picos son
agudos, estrechos y estn bien separados.

mayor precisin: independientes de los
efectos de ensanchamiento debido a las
variables experimentales
integradores electrnicos digitales
estimacin manual: triangulacin,
planmetro, pesada
Para que este mtodo sea exacto, deben darse las
siguientes condiciones:
1. Todos los analitos deben ser eluidos
2. Todos los analitos deben ser detectados
3. Todos los analitos deben tener la misma
sensibilidad
%A = rea del pico A/Ereas x 100

f
x
= f
s
(A
s
/A
x
) (w
x
/w
s
)

%X = (A
x
f
x
)/E(A
i
f
i
) 100

requiere un mtodo muy reproducible
de introduccin de la muestra
1. Debe eluir prximo a los picos de inters,
pero
2. Debe estar bien resuelto de ellos.
3. Debe ser qumicamente similar a los
analitos y no reaccionar con ningn
componente de la muestra.
4. Como cualquier estndar debe estar
disponible en forma pura.