Curso de Mestrado em Sade Pblica Centro de Pesquisas Aggeu Magalhes/FIOCRUZ

Resposta imune celular na esquistossomose mansnica crnica do camundongo desnutrido e suas relaes com a fibrognese heptica.
FABIANA LETICIA DA SILVA

Orientadora: Dra. Eridan de Medeiros Coutinho Co-orientadora: Dra. Silvia Maria Lucena Montenegro Departamento de Imunologia CPqAM/FIOCRUZ

Maro de 2007

Esquistossomose mansnica
Dados Epidemiolgicos: No Mundo 76 pases endmicos; 200 milhes de infectados; 600 milhes sob risco de infeco.
(WHO, 2002)

No Brasil 19 estados endmicos; 2,5 milhes de pessoas infectadas.

(GAZZINELLI et al., 2002)
Distribuio geogrfica das reas de transmisso de esquistossomase mansnica no Brasil (ano 2000). Fonte: GT-ESQ/COVEH/CGVEPI/CENEPI/FUNASA.

Em Pernambuco A rea endmica corresponde a 17,5% da rea total do Estado (FAVRE et al., 2001); 32.043 casos confirmados em 2006 (DATASUS, BRASIL, 2007).

Patologia:
Fase aguda Alteraes cutneas: exantema, prurido e urticria. Alteraes gerais: febre, eosinofilia, linfoadenopatia e esplenomegalia. Fase crnica Hepatoesplenomegalia Formao de granulomas Fibrose periportal

Fonte: www.who.int/tdr/diseases/chisto/diseaseinfo.htm

Granulomas Fibrose Obstruo vascular Hipertenso portal Dificulta a passagem do sangue Circulao colateral Varizes esofgicas Ascite
Fonte: www.who.int/tdr/diseases/chisto/diseaseinfo.htm

Muda a arquitetura do rgo - hepatomegalia

Resposta Imune
A inflamao granulomatosa considerada uma reao de hipersensibilidade tipo tardia, recebendo influncia direta de citocinas Th1 e Th2 (WYNN; CHEEVER, 1995).

As citocinas IFN-, IL-4 e IL-10 fazem uma regulao cruzada do balano Th1/Th2
(CHENSUE et al., 1994; JANKOVIC; SHER, 1996; WYNN et al., 1997; BOROS; WHITFIELD, 1998).

Camundongos infectados, tratados com doses gradativas de IFN-, apresentam inibio da deposio de colgeno na inflamao crnica, bem como de formao de granulomas periovulares
CZAJA et al., 1989). (GIRI; HYDE; MARAFINO, 1986;

Resposta Imune

Fonte: PEARCE. E J; MACDONALD, A S., 2002

Observaes realizadas em camundongos demonstram que a doena crnica se deve ao estabelecimento da resposta Th2 contra os ovos depositados nos diversos rgos, sendo caracterizada pela expresso de nveis maiores de citocinas indutoras do colgeno como IL-4 (FERTIN et al., 1991;
SEMPOWSKI; DERDAK; PHIPPS, 1996)

e IL-13

(CHIARAMONTE et al., 1999),

em relao

s citocinas supressoras do colgeno como IFN-

(CZAJA et al., 1993).

Resposta Imune
A resposta Th2 est, geralmente, associada a uma reao mais intensa com grande concentrao de clulas inflamatrias e maior deposio de componentes da matriz extracelular do que a resposta Th1 (CHEEVER et al., 1992). A IL-13 est claramente associada resposta Th2, que ocorre durante o aparecimento eutrficos da fibrose heptica em camundongos esquistossomticos

(CHEN; BOROS, 1999; HERNANDEZ, SHARPE; ESTADECKER, 1999; HOFFMANN;

CHEEVER; WYNN, 2000; HESSE et al., 2000).

Camundongos esquistossomticos nos quais a IL-13 estava ausente (IL-13 -/-;

FALLON et al., 2000),

ineficiente (camundongos IL-4R knockout

- JANKOVIC et al., 1999)

ou neutralizada por tratamento com anticorpo neutralizante (IL-13 R2-Fc solvel;

CHIARAMONTE et al., 1999),

falharam em desenvolver a fibrose heptica severa.

Modelos Experimentais
Os modelos experimentais tm sido utilizados para melhor compreenso da anatomopatologia, patofisiologia e imunopatologia da infeco esquistossomtica.

Modelo murino apresenta patogenia e patologia semelhantes doena humana fibrose heptica comparvel desenvolvida no homem facilmente manipulvel baixo custo de manuteno

Modelos Experimentais
Camundongos albinos Swiss eutrficos submetidos a infeces leves e prolongadas com Schistosoma mansoni desenvolvem leso equivalente de Symmers do homem (WARREN, 1966; ANDRADE, 1987; ANDRADE; CHEEVER, 1993).

Camundongos CBA/J machos, cronicamente infectados com Schistosoma mansoni, desenvolvem duas formas de leso heptica: granulomas isolados e fibrose periportal (HENDERSON et al., 1993).

Camundongos albinos Swiss desnutridos no conseguem desenvolver a fibrose heptica periportal

al., 2007 ). (COUTINHO et al., 1997; COUTINHO et al., 2003 COUTINHO et

Estado Nutricional

A deficincia protica considerada um potente imunodepressor

(MEIRA, 1995).

A inibio do desenvolvimento da fibrose periportal, em

camundongos desnutridos, pode estar relacionada com alteraes da resposta imune, refletidas no tamanho e composio dos granulomas hepticos periovulares.

JUSTIFICATIVA
Considerando que o papel das citocinas na infeco esquistossomtica vem sendo exaustivamente investigado no modelo camundongo eutrfico e tambm no homem, porm com resultados ainda discrepantes; e que so muito escassas, na literatura, as referncias sobre o perfil imunolgico e a imunopatologia de camundongos desnutridos infectados, bem como as relaes da fibrose periportal com o estado nutricional do hospedeiro, de grande relevncia que sejam realizados estudos a respeito do papel do estado nutricional do hospedeiro no desenvolvimento da imunidade celular e suas relaes com as leses hepticas esquistossomticas crnicas, em virtude do contingente de pacientes desnutridos encontrados nas reas endmicas para esquistossomose.

PERGUNTA CONDUTORA
Quais as relaes da resposta imune celular com a fibrognese heptica em camundongos isognicos desnutridos, na fase crnica da infeco por Schistosoma mansoni?

OBJETIVOS
Geral:
Avaliar as caractersticas da resposta imune do tipo celular e suas relaes com a fibrognese heptica em camundongos isognicos desnutridos, na fase crnica da infeco por Schistosoma mansoni, comparando-as com as dos camundongos eutrficos.

Especficos:

Quantificar a produo das citocinas IL-4, IL-13 e IFN-. Estudar a morfologia heptica na fase crnica da esquistossomose, em relao formao dos granulomas e suas caractersticas. Caracterizar fgado. morfometricamente parmetros relacionados aos

granulomas e quantificar bioquimicamente a produo de colgeno no

MATERIAIS E MTODOS
Animais: Camundongos machos isognicos (C57BL/6) provenientes do CECAL (FIOCRUZ /Rio de Janeiro), pesando entre 10 a 15 g, mantidos em gaiolas individuais, sob condies padronizadas de temperatura e luminosidade.

Dietas: Multideficiente, essencialmente hipoprotica - DBR - 7 a 8% de protenas (COUTINHO et al., 1997). Dieta comercial balanceada (22% de protenas). Infeco: Por via percutnea, 30 dias aps o incio do consumo das dietas, com 30 cercrias de Schistosoma mansoni (Cepa LE Belo Horizonte). Sacrifcio: Todos os animais infectados so sacrificados 20 semanas aps a infeco, no momento em que a fase crnica da infeco esquistossomtica est bem estabelecida.

MATERIAIS E MTODOS

Grupos experimentais Desnutridos

Infectados (n=15)

No-infectados (n=5) Camundongos (C57BL/6) Infectados (n=15) Eutrficos No-infectados (n=5)

Avaliao do estado nutricional: Anlise das curvas ponderais (registro semanal do peso corporal).

MATERIAIS E MTODOS
Estudo parasitolgico: a) Perfuso do sistema venoso portal para coleta e quantificao dos vermes
(DUVALL e DE WITT, 1967).

b) Contagem dos ovos contidos no fgado, aps digesto em KOH a 4%

(CHEEVER, 1970).

Estudo morfolgico: Amostras do fgado so fixadas em Bouin. Cortes histolgicos com 5 m de espessura so corados pela hematoxilina-eosina e avaliados pelo ponto de vista histopatolgico (JUNQUEIRA et al.,1979). Estudo morfomtrico: Cortes histolgicos do fgado (5 m de espessura), corados pela tcnica do picro-sirius vermelho, seletiva para colgeno, so examinados em cinco campos microscpicos escolhidos aleatoriamente, calculando-se os parmetros volume, densidade de volume e densidade numrica dos granulomas hepticos, alm da rea percentual de tecido fibroso.

 Estudo bioqumico (BERGMAN; LOXLEY, heptico medido como hidroxiprolina. Hidrlise

Amostras de fgado (100-200 mg)

1963):

quantificao do colgeno

5 mL HCl 6N

Filtrao 18h a 110C

Neutralizao
2 mL da amostra 1 gota de fenolftalena a 1% NaOH 10N HCl 3N

Colorao
200 L da amostra 400 L de lcool isoproplico 200 L de Soluo A 2,5 mL de Soluo B

Leitura a 558 nm.

Incubao a 60C por 25 minutos

MATERIAIS E MTODOS

Os

dados

coletados

so

aplicados

um

programa

computadorizado, que fornece a quantidade de hidroxiprolina em micromol por grama de fgado. Esses valores so lanados em planilha de clculo elaborada por Cheever et al., (1987), onde os nveis de hidroxiprolina so corrigidos para intensidade da infeco, dividindo-se a hidroxiprolina heptica total pelo nmero de ovos de Schistosoma mansoni no fgado.

MATERIAIS E MTODOS
Obteno de antgeno solvel de ovo (SEA):
Fgados + soluo salina a 1,7% Incubao 37C por 2 horas Filtrao em malhas de 180 m e 130 m

Triturao

Sedimentao por 2 horas

Ultracentrifugao a 104 x g por 10 a 4C

Macerao e ultrassonicao do sedimento

Cinco centrifugaes a 200 x g por 5 a 4C.

Ultracentrifugao do sobrenadante a 105 x g por 1 hora a 4C.

Dilise

Dosagem das protenas

(BRADFORD, 1976)

SDS-PAGE
(LAEMMILI, 1970)

MATERIAIS E MTODOS
Cultura de clulas esplnicas: os baos so retirados 20 semanas aps a infeco, nos diferentes grupos.
Clulas esplnicas + RPMI 1640 Lise de hemcias no sedimento 300 x g por 5 min a 4C 300 x g por 5 min a 4C Clulas + RPMI 1640 + SBF a 10%

Avaliao da viabilidade celular Trypan Blue a 10%

Meio 5 X 106 clulas/mL SEA 20 g/mL Concanavalina A 5 g/mL

MATERIAIS E MTODOS
Dosagem das citocinas nos sobrenadantes:
Anti- IL-4

Sensibilizao das placas de ELISA

Anti-IL-13 Anti-IFN

Incubao a 4C por 18 horas Lavagem Bloqueio Lavagem

Incubao por 1 hora e 30 minutos temperatura ambiente

Anticorpos biotinilados

Lavagem Incubao a 4C por 18 horas

Padres recombinantes ou amostras

Lavagem Adio do conjugado enzimtico (estreptoavidina + peroxidase)

MATERIAIS E MTODOS

leitura a 405 nm (IL-4 e IL-13) ou 450 nm (IFN-). Incubao temperatura ambiente por 1 hora Lavagem ABTS + H2O2 + tampo citrato fosfato de sdio (IL-4 e IL-13) ou TMB (IFN-)

Interrupo da reao com cido ctrico 0,2 M (IL-4 e IL-13) ou cido sulfrico a 2 N (IFN-)

As quantidades de citocinas nos sobrenadantes so calculadas a partir de curvas-padro, obtidas com concentraes de 10 a 0,625 ng/mL. Os resultados so apresentados como mdias aritmticas (X) desvio padro (DP).

MATERIAIS E MTODOS

Anlise estatstica: Anlise de varincia (ANOVA) e teste t de Student para testar as diferenas entre as mdias. O nvel de significncia considerado ser p< 0,05.

RESULTADOS ESPERADOS
Informaes sobre as relaes entre resposta imune celular e estado nutricional do hospedeiro, que possam explicar o desenvolvimento da fibrose periportal encontrada na esquistossomose hepatoesplnica experimental. Significado da correlao entre produo de citocinas e fibrognese heptica, buscando mecanismos que expliquem o no desenvolvimento da fibrose heptica periportal no camundongo desnutrido. Utilizao desses conhecimentos para embasamento de estratgias futuras de controle da morbidade na esquistossomose.

VIABILIDADE DO PROJETO
O presente trabalho est sendo desenvolvido nas dependncias do Departamento de Imunologia do CPqAM/FIOCRUZ, utilizando as facilidades existentes em termos de equipamentos e materiais de consumo.

CRONOGRAMA DE EXECUO
Atividades: 2006.1 2006.2 2007.1 2007.2 2008.1 Obteno de crditos Obteno do antgeno Pesquisa bibliogrfica Infeco de camundongos Sacrifcio de camundongos Cultura de clulas esplnicas Dosagem de hidroxiprolina Contagem de ovos Histologia e morfometria Dosagem de citocinas Redao/Documentao Defesa da dissertao

EQUIPE DE TRABALHO
Nome Fabiana Leticia Eridan Coutinho Silvia Montenegro Yara Gomes Vlaudia Costa Andria Barros Renata Ramos Roni Evncio Cludia Cavalcanti Instituio CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ LIKA/UFPE CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ CPqAM/FIOCRUZ

O tempo no algo que possa voltar atrs. Portanto, plante seu jardim e decore sua alma, ao invs de esperar que algum lhe traga flores.
William Shakespeare