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Biologa Molecular
Ingeniera Gentica Clonacin Produccin de Protenas humanas Recursos humanos qumicos raros
Nuevos Antibiticos
Terapia Gnica
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN
Son nucleasas que excinden las molculas de DNA en sitios determinados, por medio del reconocimiento de secuencias especficas Las secuencias de reconocimiento son palindrmicas Tipos de endonucleasas de restriccin: tipoI y III: cortan el DNA en sitios poco especficos y distantes del sitio de reconocimiento tipo II: cortan las dos hebras de DNA en puntos equivalentes, muy especficos, dentro de la secuencia de reconocimiento. Son las ms tiles en ingeniera gentica. EcoRI: efecta cortes escalonados en la secuencia palindrmica especfica de 6pb
EcoRI
EcoRI: genera fragmentos complementarios de hebra simple denominados fragmentos de restriccin con extremos cohesivos
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN
Sitios de restriccin: secuencias palindrmicas reconocidas por las endonucleasas de restriccin.
Eje de simetra doble EcoRV genera fragmentos de restriccin con extremos romos
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN
Nomenclatura: mediante tres letras tomadas del gnero y la especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguida de una letra que indica el serotipo y un n romano, en el caso de haber encontrado diferentes enzimas en una misma variente
Se han caracterizado ms de 3000 enzimas de restriccin de tipo II con ms de 200 secuenciaas de reconocimiento diferente
MAPAS DE RESTRICCIN
NRH
Digestin de una molcula de DNA con una enzima de restriccin. Separacin de los fragmentos de restriccin mediante electroforesis Sitios de restriccin para EcoRI
MAPAS DE RESTRICCIN
Construccin de un mapa de restriccin
MAPAS DE RESTRICCIN
NRH
Digestin del plsmido pAgK84 con: BamHI (A) PstI (B) BglII (C) HaeIII (D) HincII (E) SacI (F) XbaI (G) HpaI (H) Carril I: fragmentos de DNA de tamao conocido Aplicacin de los mapas de restriccin: polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP), valiosos para el diagnstico de enfermedades hereditarias.
MAPAS DE RESTRICCIN
Aplicacin de los mapas de restriccin: polimorfismos de longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP), valiosos para el diagnstico de enfermedades hereditarias.
Vectores de clonacin
Los vectores de clonacin son molculas pequeas de DNA que se replican de manera autnoma Tipos de vectores Plsmidos molculas de DNA circular que se encuentran en bacterias o levaduras se pueden clonar fragmentos de DNA de no ms de 10 kpb Bacterifagos fagos que infectan bacterias se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta 16 kpb Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y de levaduras (YAC) se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta varios cientos de kpb
Vectores de clonacin
PLSMIDOS Componentes bsicos de un vector de clonacin plasmdico ori HindIII PstI SalI BamHI SmaI SacI EcoRI Policonector ( polylinker ) (origen de replicacin)
Vectores de clonacin
PLSMIDOS Estructura y componentes del plsmido pUC18 (plsmido de clonacin universal)
3 genes: permiten la seleccin de clones recombinantes ampR: resistencia a la ampicilina LacZ: F-galactosidasa lacI: regulador de la expresin de LacZ
Vectores de clonacin
BACTERIFAGO P No necesaria para la infeccin ltica Fago P infectivo con un fragmento extrao de DNA enzima de restriccin y separacin de los fragmentos
Empaquetamiento in vitro Apareamiento y unin DNA recombinante Fragmento de DNA extrao de 15 kpb
El DNA P remanente contiene los genes necesarios para la infeccin pero es pequeo para el empaquetamiento
Transformacin y seleccin
Vector recombinante Cromosoma de E. Coli Transformacin de bacterias Las bacterias se crecen sobre placas que contienen agar y ampicilina (antibitico). Replicacin del plsmido Sobreviven las clulas transformadas, por poseer el gen AmpR, el resto mueren.
Multiplicacin celular
Transformacin y seleccin
Seleccin de clones que han incorporado un vector recombinante
Las clulas que incorporan un vector no recombinante (pUC18 no modificado) son azules
Genotecas de DNA
GENOTECA coleccin de clones formados a partir de todos los fragmentos de DNA del genoma de una especie, tejido o tipo celular.
GENOTECA de DNA genmico los fragmentos de DNA provienen de la escisin del genoma. Contiene regiones codificantes y no codificantes. Se genera por clonacin de fragmentos genmicos al azar.
GENOTECA de cDNA los fragmentos provienen de los mRNAs retrotranscritos. Contiene slo las secuencias expresadas de un tipo particular de clula.
mRNAs
cDNA
NRH
Eliminacin del RNA (con lcali) Adicin de una cola de polidG oligodC
Regin reemplazable EcoRI EcoRI Ligacin Empaquetamiento in vitro Viriones P recombinantes Infeccin de E. Coli Clones P individuales Vector: bacterifago
1 2
SOUTHERN BLOT
Permite identificar un fragmento de DNA individual mediante hidridacin con una sonda marcada
DNA
gel electroforesis
membrana
autorradiografa
gel
Disolucin alcalina
Transferencia del DNA, por capilaridad, del gel a la membrana; el medio alcalino desnaturaliza el DNA.
revelado
NORTHERN
Permite analizar la expresin de un mRNA determinado Etapas: Aislamiento del RNA Separacin mediante electroforesis Transferencia del RNA a una membrana de nitrocelulosa Hibridacin con una sonda marcada, complementaria al gen buscado Autorradiografa
NT
48 h
96 h
Ej.: Expresin del mRNA de F-globina en clulas diferenciadas de eritroleucemia NT: clulas no diferenciadas 48h: clulas diferencias durante 48h 96h: clulas diferencias durante 96h La intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de mRNA expresada
PCR
PCR: reaccin en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction) Permite amplificar regiones de DNA de secuencias conocidas
cebador Etapas: Desnaturalizacin del DNA: 95C Hibridacin con un exceso de cebadores: 50- 60C
Cebador: oligonucletido de 18-20 nt de longitud Tienen secuencia complementaria a los extremos 3 del segmento de DNA de inters
cebador
3)
PCR
Desnaturalizacin Hidridacin Sntesis Desnaturalizacin Hidridacin Ciclo 3 Desnaturalizacin Hidridacin
Ciclo 1
Ciclo 2
Sntesis
Sntesis
Ciclos 4, 5, 6, etc La secuencia deseada (delimitada por los cebadores) se incrementa exponencialmente, alrededor de un milln de veces despus de 20 ciclos; el resto de secuencias en la muestra de DNA original permanece sin amplificar.
CLONACIN
CLONACIN: obtencin de un clon
TCNICAS DE CLONACIN
CLONACIN de vectores recombinantes Se genera un fragmento de DNA de tamao adecuado (con una enzima de restriccin, por PCR o por sntesis qumica) El fragmento se incorpora dentro de otra molcula de DNA conocida como vector, que tiene las secuencias necesarias para dirigir la replicacin del DNA
DNA extrao Endonucleasa de restriccin Apareamiento de fragmentos de DNA extrao con el vector de clonacin y ligamiento
Vector de clonacin
DNA recombinante
El vector, con el DNA de inters, denominado DNA quimrico o recombinante, se introduce en clulas husped donde se replica. Transformacin Las clulas que contienen el DNA buscado se identifican. Seleccin
TCNICAS DE CLONACIN
Ligacin: unin de fragmentos de restriccin por una DNA ligasa
DNA vector DNA genmico (b) y (c) 2 ATP DNA ligasa T4 2 AMP + 2 PPi fragmentos de restriccin no apareados
DNA recombinante
BIOLOGA MOLECULAR
BIOINFORMATICA
Es la concertacin de tecnologas de informacin con biotecnologa y tecnologas relacionadas, que son vitales para competir. Estas nuevas tecnologas y mtodos estn cambiando procedimientos y prcticas comunes de investigacin en farmacutica, biotecnologa y ciencias mdicas.
GENOMICA
El Proyecto Genoma Humano se inici en 1990 previsto para el 2007, se termin el 26 de Junio de 2000, con la secuenciacin de todo el genoma humano de unos 30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Con la secuenciacin completa del genoma humano, los investigadores pueden mover su enfoque del hallazgo de genes, el cual puede ser manejado a travs de la base de datos, hacia el entendimiento de la funcin de dichos genes y luego a la PROTEMICA.
GENMICA
GENOMICA
El genoma humano es 10 veces mas pequeo que el genoma de la salamandra Bolitoglossa subpalmata y 200 veces menor que el de la Ameba
Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2% 20% idntico 60% idntico De 289 genes humanos implicados en enfermedades, hay 177 cercanamente similares a los genes de Drosophila.
70% idntico
98% idntico
GENOMAS VEGETALES
El 14 de Diciembre de 2000, se present la secuencia del genoma del primer vegetal Arabidopsis thaliana. El 26 de Enero de 2001, la secuencia del arroz (Orizae sativa). El funcionamiento de los genes en el arroz se aplicara a cultivos principales, tales como trigo (Triticum spp) y maz (Zea mays). El arroz tiene 50,000 genes, dos veces el de Arabidopsis, y 12 cromosomas comparado con cinco de Arabidopsis. El arroz es el genoma mas simple y pequeo de los genomas de todos los cereales.
PROTEOMICA
PROTEMICA: describir y conocer la funcin de las protenas (clave para entender y tratar las enfermedades)
Al entender a las protenas, los cientficos consideran que finalmente podrn resolver los mecanismos bioqumicos bsicos fundamentales de las enfermedades y la salud. The Wall Street Journal
BASES DE LA PROTEMICA
INGENIERA GENTICA
Inici su desarrollo en la dcada de los 70s. Con esta tecnologa, se pueden aislar los genes, manipularlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural. Estas tecnologas son intensivas en conocimiento dependen principalmente del recurso humano calificado, para utilizar adecuadamente la informacin disponible y requieren infraestructura instalada e inversiones de capital que estn al alcance de pases como el nuestro.
Identificacin de usuarios y problemas a resolver con tecnologas del ADN recombinante. Infraestructura instalada, que requiere inversiones de capital al alcance de pases como el nuestro.
Polticas Nacionales.
2a. GENERACIN DE TRANSGNICOS ARROZ con beta caroteno de genes de narciso y de Erwinia uredovora. ARROZ fortificado con un gen de la ferritina del frijol de soya. TOMATE Flavr Savr (ADN antisentido en gen de la poligalacturonasa que degrada las pectinas en la maduracin). TOMATE con tres veces y medio de beta caroteno.
2a. GENERACIN DE TRANSGNICOS Frutas y vegetales, bananos (Musa paradisiaca) y papa, para producir vacunas comestibles orales:
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APLICACIONES MDICAS
Antgenos de virus de hepatitis B y txina del clera, para inmunizacin oral. Expresin de protena de cpside del virus Norwalk, contra la gastroenteritis viral. Expresin de las porinas (protenas de membranas externas) de la Salmonella tiphi para inmunizar contra estas bacterias.
2a. GENERACIN DE TRANSGNICOS Papa con la vacuna que previene la insulina dependencia de la diabetes mellitus 100 veces ms poderosa que la actual vacuna. Papa con la sub-unidad B antignica de la enterotoxina del Vibrio cholerae causante del clera). Frijol de soya con anticuerpos que protegen contra el virus 2 de Herpes simplex (HSV). Tabaco con anticuerpos que previenen la caries dental producida por Streptococcus mutans.
APLICACIONES MDICAS
PLANTAS MS PRODUCTIVAS
Arroz con tres genes de enzimas de maz: Fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC), Piruvato ortofosfato dikinasa (PPDK), y NADP enzima malica (ME) que codifican la va fotosinttica C4 aumentaron la produccin de arroz. Estudios de campo preliminares hechos en China y en Corea mostraron respectivamente incrementos de granos de 10-30% y de 30-35% de plantas transgnicas con PEPC y PPDK.
Canola con detergente (de alto cido larico) para uso industrial y otras variedades para producir polihidroxibutirato para plsticos biodegradables. Frijol de soya con cido oleico incrementado para huevo de gallina. Maz con aprotinina para la industria farmacutica..
CLONACION
Trmino genrico para la replicacin en un laboratorio de genes, clulas u organismos de una entidad original, con copias genticas exactas del gen, clula u organismo original. Esta tcnica ha producido avances sensacionales en medicinas y vacunas. Tambin hay investigacin en clonacin de clulas humanas, rganos y otros tejidos. Esto puede producir el reemplazo de piel, cartilagos y hueso para victimas de quemaduras y accidentes, o de rganos.
Las clulas del embrin donador son separadas La clula donadora se adjunta al oocito
METODO DE CLONACION
es fusionada por una corriente elctrica
TECNOLOGAS EMERGENTES
Adicionalmente a las tecnologas de informacin estn las altas tecnologas (high tech) emergentes la Biotecnologa, con la Ingeniera Gentica como su mxima expresin y la Nanotecnologa (nanomtrica) que consiste en modificar tomos o molculas para fabricar productos (10 tomos caben en un nanmetro, mil millonsima parte de un metro).
combinar avances en biotecnologa y nanotecnologa para modificar los genes de las plantas de manera bioregenerativo para que sus clulas produzcan micro sensores, transmisores y receptores moleculares, que supervisen funciones internas de las plantas e informen sobre su salud, para garantizar una buena cosecha de manera controlable y que produzcan flores y frutos bajo comando. Una idea paralela es disear plantas que produzcan sustancias qumicas que las protegan del aumento de radiacin en el espacio y en planetas con atmsferas poco densas tales como Marte.
BIOECONOMIA
Davis y Meyer (2000) consideran que la era de la Bioeconoma, la cual predominar en el siglo XXI como la principal economa global, inici su gestacin en 1953 cuando se identific por Watson y Crick, la estructura de la doble hlice del ADN y su nacimiento fue el 26 de Junio de 2000 con la presentacin del mapa descodificado del genoma humano.