La deteccin del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnstico viral y su confirmacin.

En la ltima dcada se han desarrollado una serie de tcnicas para el diagnstico viral basadas en la deteccin de cidos nucleicos. De ellas la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es la ms utilizada.

Los mtodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, segn persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos especficos por parte del husped en el curso de la infeccin.

Son aquellos que detectan: 1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral). 2. La presencia de antgenos virales (tcnicas inmunolgicas): Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanlisis (EIA), Test de Aglutinacin. 3.La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc.). 4.El virus como partcula viral (microscopa electrnica).

Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del husped: Deteccin de anticuerpos especficos antivirales por tcnicas inmunolgicas (EIA, IFI, WB, etc.). Produccin de anticuerpos in vitro.

La inmunofluorescencia (IF) es una tcnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos. Los fluorocromos son molculas que al ser excitadas con la energa de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energa de una longitud de onda mayor.

Es una de las tcnicas ms antiguas y de uso ms difundido en el laboratorio clnico. La IF directa permite la deteccin de antgenos en un paso. Utiliza anticuerpos conjugados a isotiocianato de fluorescena. La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia, que emite luz ultravioleta de una determinada longitud de onda.
Esta tcnica se puede utilizar para una identificacin rpida del virus directamente sobre la muestra (por ejemplo: clulas eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofarngeo), o se la puede emplear para la confirmacin del efecto citoptico observado en cultivos celulares.

Muestras clnicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los antgenos vricos en el interior de las clulas. La reaccin antgeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde manzana.

La IFI, se basa en la unin de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los antgenos virales expresados en la superficie y citoplasma de clulas infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan clulas no infectadas. El procedimiento es el que sigue: Se incuba el suero del paciente con las clulas infectadas y no infectadas. Luego se realiza un lavado con PBS y se agrega posteriormente anticuerpo anti IgG humana conjugada con isotiocianato de fluorescena. El isotiocianato de fluorescena es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposicin de la luz ultravioleta y emite una luz verde caracterstica. El conjugado se unir a los anticuerpos del paciente si la reaccin es positiva, leyndose la prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la aparicin de fluorescencia en el citoplasma y superficie de las clulas infectadas, mientras que las clulas control no fluorescente.

La tcnica de WB se basa en la separacin electrofortica de protenas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto de determinar la presencia de anticuerpos especficos contra cada una de esas protenas.

Esta tcnica se realiza esquemticamente en 3 pasos:

1. Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que luego son tratados qumicamente para su disgregacin e inactivacin. Los antgenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de Poliacrilamida. 2. Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa. 3. Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa.
Posteriormente se aaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por ltimo, se agrega el substrato enzimtico para la visualizacin de las bandas reactivas con un producto final coloreado.

Se usa para amplificar una secuencia de DNA Con sta se consigue copiar millones de veces, en un par de horas, una secuencia predeterminada, dentro de una mezcla de ADN tan compleja como el propio genoma humano, donde la secuencia de inters representa tan slo una diezmillonsima parte.

ETAPAS
DESNATURALIZACIN: Se rompen puentes de hidrogeno. Las bases nitrogenadas quedan expuestas Sntesis de novo. ALINEAMIENTO/UNIN DEL CEBADOR : Se aaden los nucletidos en el hidroxilo 3 terminal del iniciador ya apareado al sitio blanco de la amplificacin. Mientras que un cebador es complementario al extremo 5 de la regin del ADN molde a amplificar, el otro es al extremo 3de la misma pero en la cadena opuesta.

EXTENSIN/ELONGACIN DE LA CADENA : Inicio de la reaccin de la PCR. Los cebadores complementarios que flanquean el sitio a amplificar se enlazan formando puentes de hidrgeno. De esta manera la polimerasa puede comenzar a extenderlos para copiar ambas hebras molde.

1 min. Para alargar 1000 nucletidos

ELONGACIN FINAL: Es comn que al finalizar todos los ciclos se realice un ltimo alargamiento por 5 min. a 72C, para asegurarse que todos los productos de amplificacin estn completamente terminados y tengan, por ende, exactamente la misma longitud

El molde utilizado es RNA pero el producto final es ADN Generacin de cDNA Enzima retrotranscriptasa reversa

Desde mediados de 1980, la metodologa de ensayos inmunomtricos (IMA) ha reemplazado progresivamente los antiguos mtodos de radioinmunoensayos competitivos (RIA) utilizados para medir la mayora de las protenas en fludos biolgicos. La ventaja principal de los mtodos, comparados con los mtodos RIA, es su sensibilidad incrementada (5 a 10 veces ms sensible), menores tiempos de incubacin y mayor rango til de trabajo.

Esquema del principio de los ensayos inmunomtricos.

El advenimiento de la tecnologa que emplea anticuerpos monoclonales (MAb), ha sido lo que fortaleci el desarrollo del IMA, ya que estos mtodos trabajan con exceso de anticuerpo?. Requieren un exceso del anticuerpo nico o mezcla de anticuerpos MAb unidos a un soporte slido. Este anticuerpo monoclonal asociado a la fase slida "capta" el analito de la muestra de suero mientras un anticuerpo monoclonal o policlonal (Pab) diferente, marcado con una seal (istopo, enzima, fluorforo, molcula quimioluminiscente o bioluminiscente), se une a un epitope (s) diferente del analito. Durante un perodo de incubacin de 0,5 - 24 horas (dependiendo del tipo de ensayo) las molculas del analito en el suero se unen tanto al anticuerpo de captura como al asociado a la seal para formar un sandwich (Anticuerpo de captura-Analito-Anticuerpo seal). Despus de lavar el soporte slido, existe una relacin lineal entre la seal unida al soporte slido y la concentracin srica del analito. Una relacin lineal entre las concentraciones de analito en los standards y la seal unida al soporte slido forma la curva de calibracin, base contra las cuales se cuantifican las muestras de concentracin desconocida.

Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo;

En ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra.

Ensayo inmunolgico colorimtrico que utiliza un anticuerpo monoclonal que actua como un anticuerpo de deteccin.
MUESTRA (Ag)

+
1 ANTICUERPO (EXCESO)

ANTICUERPO INDICADOR (marcado)

FRACCIN ENLAZADA (B)

B2

[Ag]

FRACCIN LIBRE

CURVA DOSIS-RESPUESTA

El anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un nmero limitado de sitios de unin del antgeno. Habr ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrar a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

+
ANTICUERPO (Reactivo limitante)

MUESTRA (Ag)

+
ANTGENO MARCADO

FRACCIN ENLAZADA (B) FRACCIN LIBRE -6-

B*

[Ag]

CURVA DOSIS- RESPUESTA