Estudio y Reporte de FrotisSanguneo ( Lmina Perifrica )

Lic TM Boris Valdivia V. Servicio de Hematologa HNGAI - Essalud

Extensiones Sanguneas
El frotis sanguneo consiste en la extensin uniforme de una gota de sangre sobre un portaobjetos; la misma que se lleva a cabo con otro portaobjetos El frotis sanguneo se realiza de forma manual y automatizada ( spinner )

Partes de una extensin

Cabeza - es la zona inicial de la extensin - es la regin mas gruesa - en esta regin se encuentra el mayor nmero de linfocitos y GR apilados - No es una zona de lectura Cuerpo - es la zona media del frotis - su espesor es el apropiado - en ella existe una adecuada proporcin de leucocitos - contiene la zona ideal de observacin, que corresponde a la zona que limita con la cola

 Cola - es la zona final de la extensin - suele tener un aspecto redondeado - es la regin mas fina - mayor proporcin de leucocitos grandes, hemates deformados y tonalidad uniforme

Caractersticas de un buen frotis

- la cabeza ha de estar cerca de uno de los extremos del porta - la cola debe estar cerca de uno de los bordes - toda la extensin ha de ser fina y homognea - los bordes laterales han de estar separados de los bordes del porta por 1 mm aproximadamente - presencia de barbas en el extremo terminal

Defectos de una extensin

Presencia de escalones o estras. originado por una falta de uniformidad en el momento de realizar la extensin Un lmina con zonas huecas redondeadas por efecto de restos de grasa y suciedad Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud excesivo grosor Error en el tamao de la gota Error en la velocidad de la extensin Error por causa de un ngulo inapropiado Se debe tener en cuenta el Hto del paciente, dependiendo de esta, se aplicar el ngulo apropiado de extensin

Coloraciones Hematolgicas
Las coloraciones hematolgicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloracin de las estructuras que componen las clulas sanguneas Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea, y esto permite observarlas con mayor facilidad Las tinciones hematolgicas se pueden clasificar en : De acuerdo al nivel de vitalidad de lo que se quiere colorear a . Vitales b . No vitales De acuerdo a su frecuencia : a . Rutina b . Especiales

Tinciones Habituales
Colorantes cidos: tienen especial afinidad por las estructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina. Colorantes bsicos : especial afinidad por las estructuras cidas de las clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno Colorantes neutros : son los que no tienen afinidad con las estructuras cidas o bsicas, uno de ellos es el Sudn III

 Existen tambin combinaciones de colorantes que dan origen a tinciones polcromas El primero de ellos fue Romanowsky, y todos los colorantes hematolgicos de la actualidad suelen derivar del que l prepar Estos colorantes constan de un colorante cido (eosina) y otros bsicos (tiacinas).las tiacinas son el azul de metileno y los azures Tambin existen tinciones panpticas rpidas que producen una coloracin fcil y rpida en las estructuras celulares

 Estructuras acidfilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza cida. Si captan la eosina se llaman eosinfilas. Con las tinciones habituales adquieren un color rosado Estructuras basfilas : son aquellas que fijan colorantes de naturaleza alcalina. Con los tinciones habituales adquieren un color azulado. Si se tien de lila o prpura con colorantes de tipo azur, se llaman azurfilas.

Tinciones especiales
Solo se usan en condiciones especficas Tinciones fluorescentes : emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las clulas y que, cuando son estimulados por LUV, emiten una radiacin visible caracteristica. Tinciones Citoqumicas : demuestran la presencia, mas o menos abundante, o la ausencia de determinadas sustancias y/o enzimas, localizadas en el interior de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos. Sirven para reconocer clulas normales de las anmalas, y por tanto, reconocer una leucemia de otra. Por ejemplo : PAS, Sudan Black, MPO, alfa Naftilestearasa, etc

Coloracin cida

Coloracin Bsica

Causas de Error en las Tinciones Habituales de Frotis Sanguneo

Si la tincin de una extensin sangunea es demasiado rosa, probablemente se deba a : Un pH bajo de colorante Un tiempo de coloracin insuficiente Un lavado excesivamente prolongado Si la tincin es demasiado azul probablemente sea por : Un empleo de portas sucios Falta de filtracin del colorante Una coloracin excesivamente prolongada Un secado del colorante durante al tincin Un lavado insuficiente

Preparacin del Colorante de Wright ( Merck )

Pesar 2 3 gr del colorante en polvo comercial 1000 ml de metanol Glicerina ( 5 ml ) opcional Colocar en un mortero el colorante y aadir la glicerina Aadir de a pocos el metanol al mortero e ir machacando hasta que adquiera una coloracin azul intensa y luego verter a un frasco color caramelo o mbar, previo filtrado con papel filtro Repetir la operacin hasta que se acabe el metanol Guardar en lugar oscuro, fuera de la luz para evitar su oxidacin por aprox. una semana hasta que madure Luego de cumplido el tiempo filtrar nuevamente Listo para su uso tcnica de tincin : Cubrir el frotis con el colorante por 1 3 minutos Agregar agua tamponada pH 7.2 7.4 por 5 7 minutos ( homogenizar ) Verificar la formacin de una pelcula plateada sobre el colorante Lavar con agua corriente y dejar secar Leer con objetivo de inmersin

Para tener en cuenta

Un aspecto clave es el grosor del extendido. Una extensin de calidad no debe ser gruesa ni muy delgada Una extensin gruesa dificultar la observacin de la morfologa eritrocitaria y la diferenciacin entre linfocitos y monocitos. Adems de dificultar al ojo inexperto la tincin de las clulas sanguneas Por el contrario, si es muy fina, la mayora de neutrfilos y monocitos se hallarn en las reas perifricas. Esto alterar la relacin normal de la distribucin celular leucocitaria Se recomienda entonces, que el grosor ideal, es aquel que nos permita leer a travs de la extensin

Estudio de Lmina Perifrica

El estudio de lmina perifrica comprende la evaluacin morfolgica de las tres lneas celulares ( elementos formes ) que componen la sangre Serie Blanca : Leucocitos Serie Roja : Hemates Serie Tromboctica : Plaquetas

Procedimiento del Diferencial Manual de Sangre Perifrica

Examen ocular a bajo aumento ( 10X ) Determinar las caractersticas de la tincin Determinar la distribucin celular a. verificar si hay presencia de agregados plaquetarios que pueden producir errores de conteo en los equipos o llevar a conteos bajos falsos b. Verificar la presencia de Rouleaux en GR c. verificar la presencia de agregados leucocitarios causados por inadecuada mezcla de sangre despus de su coleccin Seleccionar la mejor rea para una detallada evaluacin morfolgica a. buscar una distribucin homognea donde los eritrocitos no se sobrepongan unos a otros b. evitar reas huecas c. evitar reas extremas donde los eritrocitos adopten forman geomtricas

 Lectura a mediano aumento ( 40X o 50X ) este tipo de lectura nos sirve para tener una visin panormica y completa del frotis y es de utilidad para el personal adiestrado en el reconocimiento celular, porque nos permite lecturas a mayor velocidad, sin sacrificar la precisin. Se recomienda su uso para lminas de pacientes leucopnicos. Algunas personas inclusive pueden calcular el numero de leucocitos pmmc contando las clulas blancas normales y rotas, contando 10 campos, luego obteniendo su media y posteriormente multiplicandolo por 3000

Lectura a mayor aumento ( 100x ) Se lleva acabo usando un tabulador o contmetro, manual o digital. Deben incluirse todas las clulas de la serie blanca, maduras e inmaduras. No deben incluirse en el recuento de 100 leucocitos a los GR nucleados y megacariocitos nucleados Cualquier leucocito conteniendo una inclusin anormal deber ser reportado pero con un conteo en paralelo por las 100 clulas contadas Ejemplo : Ud observ 60 neutrfilos en su conteo de100 de los cuales 20 de ellos tenan cuerpos de Dhle, ud deber informar al final del recuento : neutrfilos (60%), y cuerpos de Dhle 20% Se deber reportar los siguientes inclusiones : - cuerpos de Dhle - cuerpos de Auer - anomala de Pelger Huet - anomala de May hegglin - inclusiones de Alder Reilly - inclusiones Chediak Higashi - granulaciones txicas - vacuolas citoplasmticas o degenerativas

 Usted deber reportar cualquier clula anormal o indiferenciada que observe Deber reportar GR nucleados si estos exceden al 6% y corregir su recuento de leucocitos con la siguiente formula :

Leucocitos contados / mm3 x 100 = leucocitos corregidos / mm3 100 + N hemates nuclados

Ejemplo : si un paciente tiene un conteo de 15,000 leucocitos pmmc y 35 % de GRN, su conteo corregido ser de 11,111 pmmc

Evaluacin de la Serie Roja

En este punto el observador deber reportar su minucioso examen de los GR, indicando la presencia de Hipocroma, Anisocitosis y Poiquilocitosis. Deber reportar tambin inclusiones eritrocitarias y hemoparsitos si los hubiera. Tambien indicar la presencia de clulas inmaduras de la serie roja si las hubieran

M A D U R A C I N

S E R I E

R O J A

 Hipocroma : cuando una clula roja individual contiene un rea plida central que es mayor a la tercera parte de su dimetro se denomina clula hipocrmica Rango medio para denominar hipocrma en 10 campos microscpicos ( 100 160 hemates por campo ) a. normocroma : 0 - 5 b. leve hipocroma : 6 - 15 c. moderada hipocroma : 16 - 30 d. marcada hipocroma : > 30 Nota : la hipercroma no esta reportada aqu pero se relaciona con la presencia de esferocitos. Hipercroma : se denomina as a las clulas rojas profundamente coloreadas en relacin al resto, y esto debido a su alto contenido en hemoglobina, mayor al que debera contener

 Anisocitosis : cuando se presenta en el campo eritrocitos de diferentes tamaos Normoctos : dimetro longitudinal : 7 8
Diamatro transversal ( espesor ) perifrico : 2 central : 1 - Superficie : 120 - 140 - Volumen : 80 95

Microcitosis : hemates con un dimetro inferior a 7 y un volumen inferior a 80 3 Macrocitosis : hemates con un dimetro superior a las 8 y un volumen superior a las 100 3 Megalocitos : hemates con dimetro superior a las 11

Rango medio para anisocitosis / 10 campos

Normal
0-5

Leve Anisocitosis
6 - 15

Moderada Anisocitosis
15 - 30

Marcada Anisocitosis
> 30

 Poiquilocitosis : cuando se presentan varias formas diferentes en los hemates en un campo microscpico Si se observa solo un tipo leve de anormalidad la poiquilocitosis ser leve, pero si coexisten diferentes formas de hemates, entonces ser marcada, no importando que individualmente sean leves Se recomienda que cada forma anormal sea evaluada separadamente
Rango medio para tipificar poiquilocitosis /10 campos

Normal Leve Moderada Marcada

: : : :

0 1 6 >

- 1 - 5 - 15 15

Acantocitos AHA A. sideroblstica AHM Enfermedad heptica Enfermedad renal Post- esplecnotoma

Drepanocitos Clulas facliformes A. drepanoctica Enfermedad Hb S - C

Esquistocitos Son GR fragmentados AHM A. megaloblastica Talasemia mayor A. hemolticas Leucemia aguda Hiperesplenismo Megalocitos

Anemias megaloblasticas
Dimetro > a 11 micras

 ANEMIA MEGALOBLASTICA
ELIPTOCITOSIS HEREDITARIA MIELOFIBROSIS TALASEMIA MAYOR TRAUMA MECANICO

Rouleaux Cuando los GR se presentan en fila de moneda Mieloma Multiple Incremento de gamma globulina Macroglobulinemia de Waldenstrom

Dianocito Clula en Tiro al Blanco

ESTOMATOCITOSIS HERDITARIA
LEUCEMIA AGUDA ALCOHOLISMO CON ENFERMEDAD HEPTICA ARTEFACTOS TALASEMIAS

Anillo de Cabot

Cuerpos de Pappenheimer

Punteado Basfilo

Cuerpos de Heinz

Pappenheimer Cuerpos de Howell Jolly

Policromatofila

Reticulocitos

 El recuento diferencial leucocitario suministra informacin sobre aspectos cualitativos y cuantitativos de los diferentes leucocitos de la sangre y permite la deteccin de clulas anormales Se basa en la observacin microscpica de 100 a 200 leucocitos dispuestos en una extensin de sangre ( frotis ) convenientemente teida La calidad de la extensin de la sangre es de vital importancia para la realizacin de una correcta lectura de la lmina.

Serie Blanca
La frmula leucocitaria es la denominacin usual que se da al recuento porcentual de los diferentes leucocitos que circulan en la sangre En condiciones de normalidad esta constituida por 5 poblaciones de leucocitos : Neutrfilos ( en su gran mayora segmentados ) Eosinfilos Basfilos Monocitos Linfocitos

Variables que pueden influir en la formula leucocitaria realizada mediante el mtodo visual
Distribucin irregular y no aleatoria de los leucocitos en la extensin Realizacin de la lectura en una zona inapropiada Variaciones de la calidad y las caractersticas de la tincin ( tincin cida o bsica ) Observacin de un nmero insuficiente de clulas Pericia del observador en la identificacin celular
neutrfilos segmentados Vs neutrfilos en banda monocitos Vs linfocitos activados o atpicos formas inmaduras de granulocitos neutrfilos

SERIE

MIELOIDE

Mieloblastos :
Es redondeado Dimetro entre 15 20 Su ncleo es grande, redondeado, rojizo y tiende a centrarse Su cromatina es laxa y contiene de 2 a 3 nucleolos visibles Su citoplasma es basfilo y algunas contienes finas granulaciones azurfilas

Promielocito : Se origina por maduracin y maduracin del mieloblasto Es redondeado Dimetro de 16 25 Ncleo grande, redondeado, menos rojizo y tiende a excentrarase Cromatina laxa y generalmente se observa nucleolos en ella, puede presentar zonas de condensacin Citoplasma abundante, repleto de grnulos primarios muy azurfilos

M I E L O C I T O S

JUVENILES O METAMIELOCITOS

METAMIELOCITOS

Metamielocitos Vs No Segmentados Regla de la Mediana

: Si al completar mentalmente la circunferencia nuclear y trazamos una lnea media imaginaria y esta muestra la hendidura antes de la media estamos frente a un juvenil o metamielocito. Si por el contrario la hendidura esta detrs de la lnea media, estamos frente a un abastonado

Juvenil

No Segmentado

Metamielocitos Vs No segmentados
Regla del Dimetro :
esta se basa en el ancho del ncleo. Si la anchura de esta es similar a la mitad de la longitud del ncleo estamos frente a un metamielocito o juvenil, en cambio si el ancho nuclear es menor a la mitad de la longitud del ncleo, estamos frente a una clula en banda.

Juvenil

No Segmentado

CLULAS EN BANDA O EN CAYADO O ABASTONADOS

Clulas Neutrfilas en Banda

Neutrfilos Vs No Segmentados
Regla del Tercio Si la estrangulacin de la continuidad nuclear es menor a un tercio de la parte mas ancha del mismo ncleo, entonces es un segmentado Regla del Filamento Se dice que estamos frente a un segmentado siempre y cuando se observe un ncleo polisegmentado y se observe al menos un puente de cromatina

Neutrfilos Vs No Segmentados

Neutrfilos

Clulas en Banda

Criterios para la diferenciacin entre neutrfilos Vs no segmentados

Fig. 2 Si seguimos con la mirada la continuidad nuclear Y en algn momento esta se entrecruza con otra Lnea del mismo ncleo , entonces lo llamamos Segmentado. Del mismo modo si al termino de la Observacin de la continuidad de la membrana Nuclear sobra ncleo lo llamamos segmentado. ( Fig. 1 ) Si al observar la continuidad nuclear no notamos Cruce de lneas, entonces lo estamos frente a un Abastonado. ( fig. 2 )

NEUTRFILOS POLISEGMENTADOS

Son clulas redondeadas, de tamao entre 12 y 14 um. Su ncleo est segmentado en 2 a 5 lbulos, unidos por unos finos puentes cromatnicos. El citoplasma es rosa plido y contiene numerosos grnulos neutrfilos que se tien de color marrn con las coloraciones panpticas habituales, as como cierto nmero de grnulos primarios ( 10 20 % ) o azurfilos dificilmente visibles al quedar enmascarados por los neutrfilos. Su ncleo es de color violeta oscuro y presenta cromatina densa Algunas veces su ncleo presenta un pequeo pndice en palillo de tambor ( cromatina sexual )

Granulaciones Txicas

Pelger - Huet

Vacuolas Citoplasmticas

Vacuolas Degenerativas

BASFILO
Poseen un ncleo bilobulado y grandes grnulos esfricos basoflicos y metacromticos dados por heparina e histamina. Liberan adems aminas vasoactivas y sustancia de reaccin lenta de la anafilaxia.

Eosinfilos

Clula redondeada 12 17 Ncleo violeta, generalmente bilobulado simtrico unido por un puente de cromatina o en forma de anteojos Presenta grnulos, grandes y acidfilos que no cubren el ncleo Estos grnulos se tien con la eosina y contienen diversas sustancias como la peroxidasa, fosfatasa cida, hidrolasas, etc

Serie Linfoide:

Linfocitos

Linfoblasto

Prolinfocitos

Linfocitos

Dimetro variable de 7 18 Pueden diferir en su relacin N/C El citoplasma es variable ( escaso o abundante ) Su coloracin es azul plida, pero aumenta en los linfos reactivos ( estimulados ) Pueden presentar una granulacin azurfila escasa en el ciptoplasma Ncleo redondeado y cromatina compacta La densidad de la cromatina puede variar entre los diferentes estados. Es generalmente elevada pero pueden presentar zonas mas laxas

LINFOCITOS ATPICOS

MAS LINFOCITOS ATPICOS

Serie Linfoctica : Criterios

Plasmocitos

8 20 de dimetro Relacin N/C 2:1 o 1:1 Ncleo redondo u oval Cromatina densa azul purpura con grandes muescas cerca al margen nuclear No presenta nucleolos Citoplasma moderado, basfilo, con zona clara perinuclear adjacente al ncleo Puede contener una o mas vacuolas No presenta granulaciones citoplasmticas

MONOCITOS

Son las clulas circulantes de mayor tamao. Poseen un ncleo excntrico en forma de U en forma arrionada El ncleo suele presentar una ubicacin central 14 20 de diametro Citoplasma abundante y de color lila plido Presenta fina granulacin azurfila Presenta cromatina laxa o filamentosa En ocasiones se halla vacualizado
Son los precursores del sistema mononuclear fagoctico, que incluye macrfagos (histiocitos), osteoclastos, macrfagos alveolares, clulas de Kupfer en el hgado y la microglia en el sistema nervioso central.

Promonocito

Serie Monoctica

Monoblasto Monocito

Serie Tromboctica
Debemos reportar la cantidad de plaquetas en lmina ( trombocitopenias o trombosis ) Debemos dar un informe detallado sobre la citomorfologa de las plaquetas Reportar si hay plaquetas normales, degranuladas, pequeas o macroplaquetas Se debe informar si existe la presencia de agregados plaquetarios Es muy importante una impecable tcnica en el momento de realizar el frotis, es decisivo.

Promegacariocito

Megacariocito en Brotacin

Megacariocito Granular

Megacariocito Productor de Plaquetas

Serie Tromboctica
Las plaquetas son las clulas sanguneas mas pequeas del organismo Se producen por fragmentacin simple del citoplasma de los megacariocitos. Son clulas anucleadas de forma discoide de 2 4 micras de dimetro y 8 micras de volumen. poseen una vida media de 7 - 10 das y su rango va de 150,000 a 450,000 pmmc

Trombocitopenia :

Leve Moderada Severa

: 150,000 - 100,000 : 100,000 - 50,000 : < 50,000

Macroplaqueta

Plaquetas Normales

450, 000 pmmc 1000,000 pmmc

se denomina trombocitosis se denomina trombocitemia

Recuento en Lmina Perifrica

Damacheck :
( Rcto 1000 GR + F ) x 100

Factor = ?
Hto 35 ( + 5 ) Hto : 35 - 39 ( + 3 ) Hto : 40 ( + 1 )