Eltroforese 2D e anlise de Proteomas

Protemica

Alguns objetivos da anlise de Proteomas

Separar, identificar e catalogar todas as protenas existente na amostra biolgica analisada. Identificar diferenas proticas especficas que diferem duas ou mais condies que esto sendo comparadas.

Anlise Protemica dirigida por dois processos:

separao de protenas e anlise espectral de massa.
Mtodo de separao de protenas

Eletroforese bidimensional
Mw e pI

Cromatografia lquida (HPLC)

Anlise espectral de massa (Espectrometria de massa)

Determinao de massa de protena intacta

Determinao de massa de peptdeos obtidos por protelise limitada

Determinao estrutural Sequncia de aminocidos

Fluxo da informao gnica

Diversidade de funes

Eletroforese bidimensional (2D)

Caractersticas da eletroforese bidimensional

1. Combinada com a identificao por MS, uma das principais tcnicas utilizadas em estudos protemicos, 2. Possibilita a separao de misturas complexas de protenas de acordo com seu pI, volume (massa) molecular, solubilidade e abundncia relativa, 3. Pode separar alguns milhares de protenas simultaneamente dependendo do tamanho do gel, da concentrao de acrilamida e bis- acrilamida e da faixa de pH, 4. Produz um mapa de protenas que reflete alteraes nos nveis de expresso, presena de isoformas e de modificaes ps-traducionais 5. Permite anlises estruturais por MALDI, ESI MS/MS ou seqenciamento de Edman

Conceitos bsicos- eletroforese

Refere-se a migrao de molculas carregadas sob a ao de um campo eltrico, Trabalho pioneiro de Arne Tiselius (1937). Prmio Nobel de 1948,
Normalmente utiliza-se a poliacrilamida como suporte para o estudo de protenas.

Eletroforese 2D
IEF A carga das protenas depende do pH do meio

Surgimento da eletroforese 2D

Dcada de 1970 cada - surge a 2D-PAGE Trabalhos de MacGillivray et al.( 1974); OFarrel (1975) ; Klose (1975).

OFarrel

Caractersticas da eletroforese 2D

Esquema bsico da eltroforese 2D

Principais componentes moleculares da bactria E. coli

Componentes H2 O Protenas Ac. Nuclico Carbohidratos Lipdeos Outros N de molculas diferentes 1 3.000 1 - DNA e 1000-RNA 50 40 ons - 12 Mol. Monomricas - 500 % peso total 70 15 7 3 2 3

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL:

Eletroforese 2D de protenas totais (proteoma) de clulas de Escherichia coli

anlise simultnea de at 5.000 protenas permite comparao de todas as protenas expressas por uma clula em dois momentos diferentes: anlise do efeito de hormnios, anlise do efeito de drogas; estados fisiolgicos (desenvolvimento); condies patolgicas diversas (vrus, bactrias,etc.)

Proteoma Comparativo ou Diferencial

condio

condio

Sobreposio permite identificar diferenas nos padres de bandas

Eletroforese 2D
As etapas bsicas: 1- Preparao das amostras, 2- Focalizao Isoeltrica (IEF), 3- Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), 4- Deteco das amostras no gel, 5- Digitalizao e anlise de imagem,
Um grande passo no uso da eletroforese 2D ocorreu com o progresso nas tcnicas analticas de identificao de protenas

1. Preparao da Amostra
Obteno das protenas
Para a focalizao isoeltrica, as protenas devem ser completamente solubilizadas, desagregadas, desnaturadas e reduzidas,
meio externo

canal de H+

Os mtodos de lise celular dependero todos da natureza da amostra (osmtica, enzimtica, com detergentes, sonicao, moagem, etc.)

citoplasma

1. Preparao da Amostra
O processo de solubilizao
Deve atingir os seguintes objetivos: Quebrar interaes macromoleculares incluindo todas as interaes no covalentes e as pontes dissulfeto, Prevenir modificaes nas protenas, Manter as protenas em soluo durante a 2-DE.

Hierarquia da estrutura de protenas

Primria - Sequncia de aminocidos Secundria diferentes regies da sequncia formam estruturas regulares como as hlices e as fitas

Terciria formadas pelo empacotamento das estruturas secundrias produzindo domnios

Quaternria formada pela combinao de cadeias polipeptdicas
Lehninger Principles of Biochemistry 3a. Ed.

Quais so os tipos de foras que mantm a estrutura tridimensional de uma protena ?

Protena Protena

NH2
CH2 OH

... O C CH2 CH2

Ponte de Hidrognio

CH2CH2NH+ O 3
Ligao Inica

Pontes de H -Aminocidos polares Ligaes inicas - Aminocidos carregados

C CH2CH2

CH2
CH3

CH CH3 CH3

CH3 CH CH2 CH CH3 H3C CH CH3 CH3

Interaes hidrofbicas -Aminocidos apolares Foras de Van der Waals -Qualquer aminocido

Interaes hidrofbicas e Foras de van der Waals

1. Preparao da Amostra
Solubilizao da Amostra
Tampes de amostra normalmente possuem: 1. Agentes caotrpicos (Uria e/ou tiouria), 2. Detergente no Inico ou zwitterinico (CHAPS, Triton), 3. Agente redutor, 4. Anflitos, 5. Inibidores de proteases

1. Preparao das amostras

Rompimento de interaes no covalentes
1. Agentes caotrpicos: Uso de reagentes caotrpicos, como, a uria, por alterarem os parmetros, do solvente exercem profundos efeitos sobre todos os tipos de interaes no covalentes. A tiouria um agente caotrpico mais eficiente que a uria, mas pouco, solvel em gua. A mistura uria-tiouria bastante eficiente.

Paba et al , 2004 Proteomics.

1. Preparao das amostras

Rompimento de interaes no-covalentes
2. Detergentes: Rompem interaes hidrofbicas, Para a focalizao isoeltrica, no podem ter carga lquida. Devem ser no-inicos ou zwitterinicos, SDS deve ser evitado!!

Os mais compatveis com as necessidades so o Triton X-100 e o CHAPS

Paba et al, 2004 Proteomics

1. Preparao das amostras

3. Agentes Redutores:
2-mercaptoetanol era usado nos primrdios. Sua ao tamponante destri o gradiente de pH na regio bsica. DTT o mais utilizado. Obs: protenas com muita cistena no so totalmente reduzidas com DTT, Tributilfosfina (TBP) o mais potente agente redutor disponvel. Obs: voltil, txico e requer solvente orgnico para dissolver em gua, Tris(carboxietil carboxietil) fosfine uma fosfina hidrossolvel.

B A

1. Preparao das amostras

Mantendo as protenas intactas

Hidrolases (fosfatases, glicosidases e proteases), Proteases so resistentes uria e detergentes, Inibidores de proteases nem sempre so suficientes. Solubilizao em SDS quente, Homogeinizao da amostra em TCA diludo ou do TCA-acetona

aminocido

Tripsina

1. Preparao das amostras

Remoo de sais

Interferem no processo eletrofortico.

Eles migram atravs do gradiente de pH produzindo calor e acumulam-se nas duas extremidades.
Zonas de alta condutividade - queda de voltagem e diminuio do campo eltrico. Protenas no focalizam e aparecem como faixas. Os gis de focalizao isoeltrica incham nessas zonas de alta condutividade devido ao acmulo de gua.

Remoo por precipitao ou dilise.

2. Focalizao Isoeltrica (IEF)

As molculas migram sob a ao de um campo eltrico em um gel contendo um gradiente de pH. A migrao se interrompe ao atingirem seu ponto isoeltrico. Aplicada a molculas que possam ser tanto positivamente ou negativamente carregadas (anfotricas).

2. Focalizao Isoeltrica (IEF)

As amostras possuem grupos ionizveis

Cadeias laterais das protenas possuem grupos ionizveis carboxlicos (Asp, Glu), aminos (Lys), imidazis (His) e guanidino (Arg)

2. Focalizao Isoeltrica (IEF)

As amostras possuem grupos ionizveis

A carga lquida de uma protena funo da soma de suas cargas negativas e positivas. A carga zero no seu ponto isoeltrico (pI), O pI de uma protena pode ser alterado por modificaes qumicas como fosforilaes, O pr-requisito para uma boa IEF a formao de gradiente de pH estvel e reprodutvel.

2. Focalizao Isoeltrica (IEF)

Gradientes de pH
A focalizao isoeltrica realizada em gis de poliacrilamida contendo um gradiente de pH que pode ser de dois tipos: Tampes anfotricos (free carrier ampholytes) Gradientes imobilizados de pH (IPG)

2. Focalizao Isoeltrica (IEF)

Tampes anfotricos (free carrier ampholytes)
CH2-N-(CH2)X -N-CH2| | (CH2) X (CH2) X | | NR2 COOH R= H ou -(CH2) X -COOH, X=2 Propriedades:boa condutividade e solubilidade no pI, alta capacidade tamponante, baixa interao com a amostra

2. Focalizao Isoeltrica (IEF)

Gradiente de pH comampholytes
Com o uso dos ampholytes o gradiente de pH formado sob ao de um campo eltrico Desvantagens: resultado depende do tempo de focalizao, temperatura e efeitos endosmticos.

Westermeier, R. Electrophoresis in Practice, WCH

2. Focalizao Isoeltrica (IEF)

Gradientes imobilizados de pH (IPG)

Strip Gel

Gradiente formado com derivados de acrilamida contendo grupos tamponantes (Immobilines) CH2 = CH-C - N - R || | O H R-grupo carboxlico ou amino Mtodo altamente reprodutvel; Propicia uma alta capacidade de aplicao de amostra e uma baixa condutividade durante a focalizao Gis prontos so disponveis comercialmente

2. Focalizao Isoeltrica (IEF)

Anflitos carreadores

pH imobilizado (Immobilines)

3- Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

SDS- Dodecil sulfato de sdio

Montagem do gel para a segunda dimenso

4. Deteco das protenas nos gis

4. Deteco das protenas nos gis

Revelao dos gis

Coomassies R250 e G250 Prata Fluorescncia (Sypro, Pro-Q e Cy Dyes) Imunodeteco

Mtodos de revelao
Propriedades desejveis
Faixa dinmica de deteco; Sensibilidade; Linearidade; Reprodutibilidade;

Compatvel com espectro de massa;

Baixa toxicidade;

Baixo custo.

Mtodos de revelao
1 g de Protena

Revelao por Coomassie

Revelao pela Prata

(Lpes, 2007)

Revelao por Azul de Coomassie (COOMASSIE BLUE)

Vantagens Intensa capacidade de colorao; Elevada solubilidade em gis de poliacrilamida e agarose; Capacidade de distino entre pnt e Aa.;

Compatvel com Espectro de Massa;

Estvel na forma slida; Fcil manuseio; Baixo custo.
(Fazekas de St. Groth et al., 1963)

Anlise de gis corados com Comassie

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Jos Maurcio Maciel Cavalcante PPGCV-UECE

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

uma metodologia de eletroforese (2D) onde utilizado at trs diferentes amostras de protenas marcadas com corantes fluorescentes (Ex.: Cy3, Cy5, Cy2) antes da eletroforese 2D. Aps a corrida eletrofortica, o gel escaneado com o comprimento de onda de excitao de cada corante um aps o outro. utilizado para observao de mudanas no perfil protico entre amostras. Ex: Perfil de protenas de pacientes saudveis e doentes. Vantagem sobre a eletroforese 2D tradicional: - Evita diferenas do perfil eletrofortico devido variaes entre gis - Consome menos tempo

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

CyDye Famlia cianinas (corantes sintticos)

Trs corantes com diferentes comprimentos de onda de excitao e emisso: Cy2,Cy3 e Cy5

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Marcao mnima (minimum labelling)

Corante ligado N-hidroxi-succinimidila (NHS) Ligao covalente ao resduo de lisina da protena

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Marcao mnima (minimum labelling)

Marcao de 1-2% das protenas disponveis e apenas uma nica lisina/protena marcada (um corante por protena)
Carga da lisina carga do CyDye: pI da protena no alterado. Corante x PM das protenas marcadas protenas de baixa massa molecular Pode ser utilizado para espectrometria de massa Alta sensibilidade: detecta at 125 pg de protena

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Marcao por saturao (saturation labelling) Apenas Cy3 e Cy5 podem ser modificados para tcnica Usado para pequenas quantidades de protena 5 g

Corantes ligados maleimida ligao covalente ao grupo tiol dos resduos de cistena
Todos os resduos de cistena so marcadas Corantes possuem carga eltrica neutra, no altera pI das protenas

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Eletroforese em gel diferencial (Difference gel electrophoresis -DIGE)

Digitalizao das imagens Typhoon 9400 (GE Helthcare)

Autoradiografia Fluorescncia excitao azul (457, 488 nm) (Cy2) Fluorescncia excitao verde (532 nm)(Cy3) Fluorescncia excitao vermelho(633 nm) (Cy5) Quimoluminescncia

5. Digitalizao das amostras

Software para a anlise de experimentos com DIGE DeCyder (v7.0 - GE Healthcare) - Anlise diferencial in-gel - Anlise de variao biolgica (entre geis) - Mdulo de anlise estatstica - Remoo de artefatos - Subtrao background Plataforma: R$124.195,40

Racional do gel 2D DIGE

2-D DIGE / Vantagens e desvantagens

Menor tempo de anlise, Alta sensibilidade (125 pg/spot), Maior acurcia nas comparaes de protenas entre diferentes amostras/ deteco de diferenas de 10% nos nveis de expresso com 95% de confiana, Dificuldade de cortar spot para anlise posterior (marcao posterior / spot picker), Caro!!!

Limitaes da abordagem 2D-PAGE/MS

Protenas de membrana Protenas com extremos de pI e MM Obrigado! Tcnica trabalhosa De difcil automao Difcil reprodutibilidade Intervalo dinmico de Mr Protenas pouco abundantes (50-75%)

Limitaes da eletroforese 2D

2D ou no 2D?
Se o objetivo prover uma lista de todas as protenas presentes em uma amostra, metodologias baseadas em cromatografia multidimensional acoplada espectrometria de massa em sequncia (MS/MS) pode fornecer resultados superiores Se o objetivo for observar mudanas quantitativas na expresso de protenas ou suas modificaes ps traducionais durante um processo biolgico, os gis bidimensionais ainda so inigualveis.

Exemplo de trabalhos usando 2D