DNA recombinant technology

Definisi teknologi DNA rekombinan

Serangkaian prosedur utk menggabungkan fragmen DNA. Pada kondisi tertentu molekul DNA rekombinan dpt masuk dlm sel dan mengalami replikasi.

Objective
Dalam rangka karakterisasi gen atau studi fungsi biologi dari suatu protein , perlu dilakukan isolasi dan amplifika si gen. Teknologi DNA rekombinan adalah metode isolasi dan amplifikasi gen

Tujuan utama teknologi rDNA adalah utk membuat DNA / gen dan atau protein nya dlm jumlah banyak. Proteins (Ex: Insulin)

Prinsip dasar teknologi DNA rekombinan

DNA dimasukan kedalam molekul DNA lain, yg disebut vektor. Vektor rekombinan selanjutnya dimasukan kedalam sel host, lalu mengalami replikasi shg dihasilkan gen

Garis besar:
Komponen Tahapan teknologi DNA Recombinan Pemilihan penanda Analisis hasil Pemecahan masalah dari teknologi DNA rekombinan . Perbandingan PCR dan teknologi DNA rekombinan

Teknologi DNA Rekombinan: Kloning DNA

KOMPONEN: Vektor Plasmid atau virus. Harus memilikki: Gen Antibiotic Resistance & Gen Lac Z untuk seleksi warna DNA atau Gene untuk Klon Restriction Enzyme DNA Ligase Antibiotics Pewarna X-gal yang tidak berwarna sebuah host, biasanya bacteria

Plasmid Vector dengan AmpR (Ampicillin Resistance gene)

Teknologi DNA Rekombinan: Kloning DNA

Meliputi 5 langkah:

Perlakuan dengan enzim restriksi

Ligasi
Transformasi Host Pertumbuhan Transforman

Seleksi recombinan

Tahapan dalam Teknologi DNA Recombinan Perlakuan dengan Enzim Restriksi

Perlakukan DNA yang akan di Klon & Vektor Enzyme restriksi

yang SAMA. Ex: EcoRI, untuk menghasilkan ujung lancip yang bersifat komplementer sehingga basa dapat berpasangan

List of Possible Restriction Enzymes

Tahapan dalam Teknologi DNA Recombinan

Ligasi
DNA Ligase menyambung ujung DNA klon & DNA vektor

DNA sekarang dimasukan ke dalam DNA Vektor => Recombinant DNA

LacZ gene AmpR

DNA insert Vector

Recombinant Plasmid DNA

Ligasi ujung lancip vector dan DNA insert

Tahapan dalam Teknologi DNA Recombinan

Hasil Ligasi:
a. Beberapa vector berligasi dengan insert.

b. Beberapa vector mengalami re-ligasi tanpa insert.

c. Vektor dan inserts tidak mengalami ligasi

Tahapan dalam Teknologi DNA Recombinan

Transformation of Host
DNA Recombinandan semua produk ligasi dicampur dengan larutan host. Bahan kimia digunakan untuk mengaktifkan serapan oleh host Host dengan vector atau DNA rekombinan dinamakanTransformant (transformed host) Host sekarang menjadi antibiotic resistant

Transformandapat mereplikasi DNA insert

Tahapan dalam Teknologi DNA Recombinan

Hasil transformasi:

Beberapa host tidak menyerap apaapa Beberapa host menyerap vector saja Beberapa menyerap DNA rekombinan

Tahapan dalam Teknologi DNA Recombinan

Hasil transformasi
A

= Plasmid = Insert
a. Vectors ligated to the insert. b. Vectors ligated without insert. d. Vectors ligated to 2 copies of insert

A. = Host transformed by a.
B

B. = Host transformed by b.

Bacterial Genome

C. = Host not transformed.

C Agar Plate with Ampicillin+X-Gal

D. = Host transformed by a with 2 inserts.

Manakah yang akan tumbuh dalam media agar di atas? Mengapa? Which ones Mana yang akan membentuk koloni biru? Mana yang membentuk koloni putih?

Tahapan dalam Teknologi DNA Recombinan

Pertumbuhan Transforman
Agar Plate with Ampicillin + X-Gal

Transformants dan produk lainnya ditumbuhkan dalam cawan yang berisi: nutrients Antibiotic a colorless dye called X-gal (5-bro mo-4kloro-indolil--galaktopiranosida) LacZ merubah X-gal menjadi berwarna biru.

Recombinant l virions form plaques

Transformants yang mengandung DNAplasmid atau DNA plasmid recombinant akan membentuk KOLONI (benjolan) pada cawan
Transformants yang mengandung vektor virus atau DNA virus

rekombinan membentuk PLAQUES (penyok)

Tahapan dalam Teknologi DNA Recombinan

Selection for Recombinant

X-gal dalam cawan nutrisi memungkinan seleksi keberhasilan ligasi DNA insert : Inactivation of LacZ gene Warna putih (tidak ada warna biru)
Ampicillin dalam nutrien memungkinkan seleksi keberhasilan transformasi

Analysis of Recombinant DNA Technology Results

Selection for Recombinant
Agar dish after rec DNA Technology shows both blue and white (clear) colonies.

WHY both blue and white (clear) colonies?

Koloni berwarna apakah yang diinginkan? Jika anda lupa menambahkan antibiotics pada plate, Hasil apa yang anda harapkan?

SUMMARY
1. Teknologi DNA rekombinan dapat menghasilkan sejumlah besar DNA dan protein

2. Penemuan enzim restriksi menjadi sangat penting dalam teknologi DNA rekombinan Baik vector & DNA insert harus diperlakukan dengan enzim restriksi yang sama 3. Keberhasilan ligasi (recombinasi) DNA vektor dan DNA insert akan menonaktifkan enzim lacZ => Koloni berwarna putih

4. Transformasi yang berhasil (mengandung vector saja atau recombinant DNA) membuat hosts antibiotic resistant

Aplikasi Teknologi DNA Rekombinan

Produksi skala besar protein manusia melalui rekayasa genetika bacteria. Seperti: insulin, hormon pertumbuhan, Interferons and faktor pembekuan darah(VIII & IX)

1)

Production of Human Insulin

Isolasi / mendapatkan gen insulin manusia Gen insulin manusia dapat diperoleh dengan membuat kopi DNA komplementer (cDNA) messenger RNA (mRNA) untuk insulin manusia.

2)Memasukan gen insulin manusia ke dalam plasmid vector

Plasmid bakteri dan cDNA dicampur. Gen insulin manusia (cDNA) dimasukan ke dalam plasmid melalui perpasangan basa komplementer pada ujung lancip.

3)Memasukan DNA plasmid rekombinan ke dalam bacteria

Bakteri E.coli digunakan sebagai host cell. E. coli dan plasmid rekombinan dicampur bersama dalam tabung reaksi.

4)Seleksi bacteria yang telah mengambil bagian yang benar DNA

Bakteri ditumbuhkan dalam nutrient agar. Agar juga mengandung zat seperti antibiotic yang hanya memungkinkan pertumbuhan bakteri transforman