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DIANA MILENA PETRO BEGAMBRE JORGE ELIECER GAITN VSQUEZ

Los anticuerpos anti-DNA del suero se unen a su correspondiente antgeno presente en Crithidia luciliae. Una vez unidos, los anticuerpos se ponen de manifiesto mediante la incubacin con un anticuerpo contra las inmunoglobulinas humanas conjugado con fluorescena y se visualizan por microscopa de fluorescencia1.

Fueron descubiertos en 1957. Considerados como "marcadores de LES.

Tambin

pueden presentarse enfermedades autoinmunes.

en

otras

Anticuerpos anti-DNA de una sola cadena Bases pricas o pirimidnicas del DNA

Anticuerpos anti-DNA de doble cadena Solo pueden unirse a la poliribosafosfato

Los nuclesidos.
Nucletidos

Pares de bases desoxiguanosinadesoxicitidina.


Pares de bases desoxiadenosinadesoxitimidina.

Oligonucletidas.
Cadena de ribosa-fosfato.

Algunas conformaciones muy especiales de la doble hlice.

La

mayora de las personas presentan anticuerpos anti-DNA de cadena sencilla pero estas presentan poca afinidad y no son de mucha importancia.

Mientras que los anticuerpos anti-DNA de cadena doble muestran una alta afinidad hacia el DNA, tambin son capaces de fijar molculas de complemento y los complejos que forma contienen secuencias de aminocidos que les confieren su patogenia.

Se usan para el diagnstico de LES:


Alta especificidad (95%). Baja sensibilidad (30-70%).

A. Portaobjetos: Crithidia luciliae fijadas en cada pocillo.

B. PBS (10x): Fosfato de sodio 112, 5 mmol/L, fosfato de

potasio, 30mmol/L, cloruro sdico 1,15 mol/L, azida de sodio 0,95 g/L, pH 7,2.
C. Control Positivo nDNA: Suero humano con anticuerpos

anti-DNA nativo (nDNA), azida de sodio 0,95 g/L.


D. Control Negativo: Suero humano, azida de sodio 0,95 g/L.

E. IgG FITC/Evans (R, CL): Anticuerpos de cabra antiinmunoglobulinas IgG humanas conjugados con isotiocianato de fluorescena (FITC), azul de Evans 0,01 g/L, azida de sodio 0,95 g/L F. Mounting Medium. Medio de Montaje: Glicerol 78%, fosfato de sodio 6 mmol/L, fosfato de potasio 1,6 mmol/L, cloruro de sodio 60 mmol/L, azida de sodio 0,95 g/L. G. Papel secante.

PBS:

Efectuar una dilucin 1/10 del PBS con agua destilada. de

Estable 1 semana

2-8C.
Los dems componentes

estn listos para su uso.

Suero o plasma recogidos

mediante estndar.

procedimientos

Estable una semana a 2-8C. Diluir las muestras 1/10 en

PBS antes del ensayo.

PROCEDIMIENTO
PASO 1 Atemperar los reactivos y las muestras a temperatura ambiente.

PROCEDIMIENTO
PASO 2 Depositar una gota (25L) de la muestra diluida o de los Controles en los pocillos del portaobjetos, procurando cubrirlo perfectamente.

PROCEDIMIENTO
PASO 3 Incubar el portaobjetos en cmara hmeda durante 30 minutos a temperatura ambiente (15 a 30C).

PROCEDIMIENTO
PASO 4 Eliminar las gotas de las muestras inclinando el portaobjetos y golpendolo ligeramente. Evitar la mezcla de sueros.

PROCEDIMIENTO
PASO 5 Eliminar el suero remanente en el portaobjetos lavndolo con PBS.

PROCEDIMIENTO
PASO 6 Lavar el portaobjetos sumergindolo en una cubeta con PBS durante 5 minutos. Cambiar el PBS y repetir el lavado.

PROCEDIMIENTO
PASO 7 Secar cuidadosamente el portaobjetos utilizando el papel secante suministrado. La preparacin de clulas debe permanecer siempre hmeda.

PROCEDIMIENTO
PASO 8 Depositar una gota de Reactivo D en cada pocillo. Colocar el portaobjetos en una cmara hmeda e incubar a temperatura ambiente (15-30C) durante 30 minutos.

PROCEDIMIENTO
PASO 9
Lavar y secar

PROCEDIMIENTO
PASO 10 Depositar varias gotas de Reactivo E sobre el portaobjetos y colocar un cubreobjetos procurando evitar la formacin de burbujas de aire.

Examinar el portaobjetos con

un microscopio fluorescencia.

de

Es recomendable realizar la

lectura de inmediato.
Para realizar la lectura, se

hace entre el centro y la periferia del pocillo, con distribucin de clulas uniformes.

Crithidia luciliae

El Control Positivo (C+) y el Control Negativo (C-) suministrados

con los kits deben ser ensayados junto con las muestras de los pacientes para verificar la funcionalidad del procedimiento de ensayo.
El Control Positivo debe proporcionar el marcaje especfico.

El Control Negativo no debe proporcionar marcaje especfico

alguno.
Cada laboratorio debe establecer su propio programa de Control

de Calidad interno, as como procedimientos de correccin en el caso de que los controles no cumplan con las tolerancias aceptables.