Universidade dos Aores Departamento de Cincias Agrrias Mestrado em Engenharia Agronmica Biotecnologia Vegetal 2011/2012

Biotecnologia Vegetal da Clonagem de Plantas Transformao Gentica

Autor: Jorge M. Canhoto

Capitulo 2 Cultura in vitro

Por cultura in vitro entende-se o estabelecimento e manuteno, em condies laboratoriais de clulas, tecidos, rgos vegetais, plantas ou massas de clulas, vulgarmente designadas por calos (callus).

Objectivos clonagem de plantas produo de metablitos secundrios

transformao gentica
fuso dos protoplastos obteno de plantas haplides

2.2 Totipotncia da clula vegetal

As clulas de um organismo tm uma origem comum, o ovo ou zigoto. O corpo da planta excepo dos gametfitos um clone do zigoto.

base da reproduo assexuada diferenciao desdiferenciao clulas do parnquima

A totipotncia constitui a base da reproduo assexuada devido capacidade que as clulas vegetais, em cultura, darem origem a novas plantas sem a interveno de um processo de reproduo sexuada.

2.3 - Multiplicao Vegetativa

Segundo alguns autores, como Margara (1984), a multiplicao vegetativa nas condies naturais ter essencialmente um papel benfico a curto prazo, permitindo a colonizao acelerada de novos habitats.

2.4 Mtodos convencionais de multiplicao vegetativa

reproduo por estaca enxertia
limitaes

nmero reduzido de plantas obtidas morosidade do processo disponibilidade de meios necessrios para a concretizao dessas tcnicas

2.5 A cultura in vitro de plantas

Obteno de um nmero elevado de plantas para ensaios na agricultura num curto espao de tempo partindo de um explante diminuto.

Possibilita a propagao de espcies difceis de clonar por tcnicas convencionais.

Permite a produo de clones ou de novas variedades

Essencial na regenerao de plantas a partir de clulas geneticamente modificadas.

Pode ser utilizada para o estabelecimento de bancos de germoplasma.

Permite uma rpida troca de material vegetal.

2.5.1 Condies de Cultura

Recipientes ou frascos Erlenmeyers Caixas de Petri Tubos de ensaio

Utilizam-se tampas de plstico ou metlicas para reduzir as trocas gasosas entre o explante e o exterior sendo o uso de tubos de ensaio tapados com rolhas de algodo cardado e gaze o mais frequente.

Assepsia
A realizao das culturas deve ser feita, sempre que possvel, em camaras de fluxo onde o ar filtrado assegurando assim a supresso de microrganismos vindos do exterior.

Factores Fsicos
Temperatura (22 -25 C) Luz tubos fluorescentes Humidade relativa obliterao dos recipientes

O Meio de Cultura

meio solido (gelificado) agar

Ao solidificar o meio forma um complexo coloidal que facilmente liberta os ies

meio liquido propagao de plantas em ecossistemas aquticos pH dos meios 5,6 5,8
Elementos Minerais
Macroelementos Microelementos
Carbono ,oxignio ,hidrognio ,azoto, fosforo, enxofre, potssio, magnsio ,clcio B, Cu, Fe, Mn, Mo e Zn

Vitaminas e aminocidos
Tiamina (vitamina B1),cido nicotnico, a riboflavina e a piridoxina (vitamina B6). Glicina

Outros Compostos
cido ascrbico, a cistena, o ditiotreitol e a polivinilpolipirrolidona leite de coco sacarose auxinas citocininas

3 CLONAGEM DE PLANTAS Proliferao de meristemas e organognese

Os mtodos de micropropagao de plantas podem dividir-se em trs tipos diferentes, consoante o material inicial e o tipo de resposta obtida. Esses tipos so a proliferao de meristemas existentes no explante original, a induo de organognese e a formao de embries somticos.

Tipos de Meristemas
Do ponto de pista da micropropagao os meristemas mais interessantes so os meristemas apicais do caule e os meristemas axilares.

Meristema apical do caule

fitmeros

Cada fitmero , potencialmente uma planta, uma vez que apenas lhe falta uma raiz para que assim se possa considerar.
O meristema apical do caule constitui para a edificao da planta atravs de: funes de iniciao de rgos Tecidos Sinais de comunicao Da sua prpria manuteno Um segundo tipo de organizao para o meristema apical do caule baseia-se numa diviso de em zonas: Zona central Zona perifrica Zona de nervura

Funcionamento do meristema
possibilidade de estudar os mecanismos que controlam o crescimento, a dormncia, a expresso de genes hometicos ou de outros genes, os ciclos reprodutivos o outros processos fisiolgicos que ocorrem naquela zona.

Limitaes difcil isolar apenas o meristema e, noutros casos, a sua manuteno e

crescimento in vitro , so problemticos.

Propagao em larga escala

aplicao mais importante da cultura de meristemas

As 3 fases de Murashige (1974): Estabelecimento dos explantes in vitro Multiplicao Enraizamento Fase inicial de preparao da planta me Fase final de aclimatizao.

In vitro

Solo

Capitulo 4 Embriognese Somtica

Embries com origem em clulas do corpo (soma) podem tambm ser produzidos.

Estes embries designados somticos so como os zigticos e possuem o mesmo gentipo da planta me.

Os embries zigticos tm origem unicelular enquanto os somticos podem ter origem unicelular ou multicelular. No uso de embries somticos para a regenerao de plantas geneticamente transformadas fundamental possurem uma origem unicelular porque se forem de origem pluricelular pode-se correr o risco de as plantas regeneras apresentarem sectores transformados e outros no, quimeros.

Capitulo 8 Transformao gentica de plantas

A transferncia de genes de plantas selvagens, apresentando caractersticas de interesse, para as plantas cultivadas ou a combinao das caractersticas dos progenitores nos hbridos tornou-se uma prtica comum e permitiu, na ltima metade do seculo XX, ganhos de produtividade absurdos.

Foi tambm possvel verificar que manipulaes do DNA atravs da induo de mutaes com obteno de haplides, poliplides e aneuplides permitiam obter novas plantas com novas caractersticas com potencial interesse sob vista agronmico.
Assim constata-se que todas as variedades de plantas que actualmente consumimos resultaram de profundas alteraes genticas introduzidas no seu genoma por cruzamentos ou por manipulaes grosseiras do seu DNA. O uso de engenharia gentica associadas totipotncia da clula vegetal cada vez mais frequente. Tudo comeou na planta do tabaco e desde ento comeou a ser realizada em centenas de espcies.

Transferncia de genes por cruzamento e seleco A 1 fase de um melhoramento clssico inicia-se com a escolha criteriosa das plantas a cruzar. A escolha da espcie mais produtiva e/ou resistente a doenas/fungos ira passar essas caractersticas variedade que queremos manter. A 2 fase do processo consiste em cruzar a variedade que se pretende melhorar (planta recorrente) com a variedade resistente (planta doadora). O resultado uma 3 gerao (F3) onde se voltam a seleccionar aquelas que apresentam caractersticas fenotpicas da variedade inicial resistentes a fungos. O processo repetese de 3 a 5 vezes at temos uma nova variedade que possui o genoma da variedade inicial mais o gene ou genes com caractersticas que se pretende preservar. O processo descrito foi a insero de novos genes na planta original sem recorrer a qualquer manipulao laboratorial do ADN.

Plantas geneticamente modificadas por engenharia gentica As plantas podem ser geneticamente modificadas pela insero de genes ou pela inactivao dos mesmos. insero do gene (ou genes) nas clulas vegetais utilizando um vector

Agrobacterium tumefaciens
o mtodo de transformao mais utlizado recorrendo ao Agrobacterium, uma bactria Gram-, flagelada, pertencente famlia Rhizobiaceae, fitopatognica, que vive no solo e que responsvel por uma doena das plantas chamada crown gall (galha-do-colo).

Induo dos genes vir

O sistema que permite as clulas bacterianas detectar os sinais qumicos emitidos pelas clulas vegetais componentes um sistema de dois componentes constitudo pelos produtos dos genes vir A e vir G, genes que se exprimem constitutivamente na bactria.

Processamento do T-ADN A activao dos genes vir tem como consequncia a clivagem de uma molcula de TDNA de cadeia nica do plasmdeo Ti e que ir ser incorporada nas clulas vegetais.

A utilizao de A. tumefaciens na transformao experimental de plantas A A. tumefaciens pode ser utilizada como um veculo para a introduo de genes nas plantas permitindo assim a obteno de plantas geneticamente transformadas. Para que o plasmdeo Ti seja utilizado necessrio estar desarmado e perca a capacidade de infectar os tecidos da planta. Genes quimricos O gene quimrico deve possuir uma sequncia responsvel pela produo de um factor que permita a seleco ou a identificao das clulas transformadas. Esses genes so designados por marcadores e podem ser genes reprter ou genes de seleco. A transformao gentica de plantas com A. tumefaciens A transformao das clulas vegetais com A. tumefaciens apresenta algumas vantagens como sejam o facto de se tratar de um sistema natural capacitado para a introduo de ADN em clulas vegetais de forma precisa e estvel.

Capitulo 9 Plantas com novas caractersticas obtidas por transformao gentica resistncia a factores biticos ou abiticos produo de protenas recombinantes interesse farmacutico modificao dos alimentos suprir deficincias nutritivas resultantes de dietas alimentares deficientes Plantas tolerantes a herbicidas princpio activo a fosfinotricina (PTT)
herbicida no toxico para os animais, efectivo a baixas concentraes e facilmente decomposto no solo sem permanecer muito tempo no ecossistema.

Plantas resistentes a insectos

toxina Bt produo de protenas antivirais

Plantas resistentes a agentes patognicos Plantas resistentes a factores abiticos Produo de compostos de interesse biorreactores produo de anticorpos em plantas

Alterao das propriedades dos alimentos -caroteno arroz geneticamente transformado

objectivo de colmatar as deficincias em vitamina A Alteraes no amadurecimento dos frutos Tomate Flavr Savr obtido atravs da insero na planta de uma sequencia codificadora para uma RNA antisense da enzima poligalacturonase (PG),. Alteraes na colorao das flores modificao das vias de sntese dos pigmentos antocinicos.

Alterao nos teores de lenhina Esta manipulao tem dois objectivos como a reduo dos teores em lenhina sem que isso afecte a arquitectura e a estrutura do lenho e desse modo interfira no desenvolvimento das rvores e as tentativas de modificar a composio da lenhina de forma a tornar a sua separao de celulose mais eficaz.

Rendimento das culturas Reduo de perdas devido a factores biticos e abiticos Aumento de rendimento tornando as plantas mais eficazes em termos fotossintticos Tecnologia Terminator

TPS ( Terminator Protection System) afecta a viabilidade de sementes impedindo que elas sejam utilizadas em novos ciclos de propagao.

Capitulo 10 Impacto das plantas geneticamente modificadas Sade Pblica Toxicidade Doenas Cancergenas

Ambiente Plen milho Bt diminua a taxa d sobrevivncia das borboletas monarca

Sem fundamento cientifico.

Cada vez que se cria um novo conhecimento h pessoas que resistem, que o negam. Mas no final a verdade e a cincia triunfam.