ACCURACY AND PRECISION

Sukarti Moeljopawiro
Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi

Accuracy and Precision

Accuracy:
May be defined as the degree of conformity to the truth

Precision:
The degree of agreement between replicate experiments Precision does not mean accuracy, since measurements may be highly precise but inaccurate due to a faulty instrument

Type of errors
Errors may be:
Random Careless Inaccurate instruments

Random error which are individually unpredictable Errors can arise from careless experiments work:
Using apparatus wrongly Do not read the manufactures instructions Using broken instruments

Standard and blank

To obtain a value as accurate as possible from an estimation errors must be reduced to a minimum This can be done by:
Careful working Using standard solution Using a blank

Standard solution:
Should be included in all measurements Should be treated in an identical manner to the fluids under investigation Function: provides a useful check on the accuracy of a method

Standard and blank (contd)

Blank solution:
Should be included in any measurement The same volume of distilled water replaces the substance to be estimated Should be treated in exactly the same way as the test and standard Function: provides a useful check on the reagents purity

The function of standard and blank: to correct the obtained value Several blanks and controls need to be used when working with enzymes

Glassware

Macam Glassware
Pipet gondok (Volume pipette) Pipet ukur (Graduated pipette) Pipet tetes (Pasteur pipette) Pipet mikro

Labu godog (Digestion flask) Labu ukur (Volumetric flask) Labu pemisah Gelas piala (Beaker glass) Botol timbang Gelas arloji Gelas ukur (Measuring cylinder) Erlenmeyer (Erlenmeyer flask)

Buret makro Buret mikro Buret semimikro

Cleaning glassware
Grease rag soaked in chloroform or benzene and soaking overnight in chromic acid Very dirty apparatus soaking in a mixture of concentrated nitric and sulphuric acids After rinsing in tap water followed by several rinses in distilled water Normal glassware dried in an oven Volumetric glassware rinsed with alcohol then dried warm air

Terima kasih

CHROMATOGRAPHY

Sukarti Moeljopawiro
Laboratorium Biokimia Fakultas Biologi

Separation of Compounds of Biological Origin

Using: Extremes of temperature Extremes of pH Organic solvents Oxidizing agents Reducing agents have to be avoided

Extreme physical conditions may: Irreversibly change the structure of the molecules Destroy any biological activity

Chromatography
This technique utilizes differences in the basic physical properties: Mass Size Shape Charge Adsorption effect

Chromatography (contd)
A three component system is involved: The mixture to be separated (liquid) A stationary phase (column or film)
Solid play an active part in the separation process

The mobile phase

Liquid (in most case) provides a medium for the molecules to move through

Kinds of Chromatography
Gel Filtration Adsorption Chromatography Ion Exchange Chromatography Partition Chromatography
Paper Chromatography Thin-layer Chromatography

Gas Chromatography
Gas-liquid Chromatography Gas-solid Chromatography

Gel Filtration

Gel Filtration (contd)

Adsorption Chromatography
Adsorption (chem.) : The taking up of one substance at the surface of another Absorption (chem.) : Penetration of a substance into the body of another Adsorbent (chem.) : The substance, either solid or liquid, on whose surface adsorption of another substance takes place Chamber Dictionary of Science and Technology. Chambers Edinburgh.
A

Solute
D A and C B D and E

Solute

Solvent
E

Solvent

Adsorbent

: Association-dissociation phenomena : Solvation of solute : Interaction with adsorbent

Adsorption Chromatography
(contd)
Solvent reservoir

Filter paper disc

Adsorbent

Glass wool Collecting tube

Ion Exchange Chromatography

+ +

+
+

+ + +

ANION exchanger with exchangeable counter ions

CATION exchanger with exchangeable counter ions

Ion Exchange Chromatography

(contd)

Partition Chromatography
Two kinds of Partition Chromatography:
Paper Chromatography Thin-layer Chromatography (TLC) Partition Chromatography for the compounds that are soluble in both water and organic solvents
Adsorption Chromatography for the compounds that are readily soluble in organic liquid but sparingly soluble in water Ion Exchange Chromatography for ionizable water soluble compounds

Paper Chromatography
Based on direction of solvent flow:
Ascending Chromatography Descending Chromatography Circular Chromatography

Rf =

Distance of migration of X Distance moved by the solvent

Ascending Chromatography

Descending Chromatography

Circular Chromatography

Thin-layer Chromatography
This method is very rapid (many separations can be completed under an hour) The spots are very compact (so it is possible to detect compounds at low concentration) Compounds separation is much better than paper chromatography Separated compounds can be detected using corrosive sprays at high temperature

Thin-layer Chromatography
(contd)

Thin-layer Chromatography
(contd)

Two Dimensional Thin-layer Chromatography

Two Dimensional Thin-layer Chromatography (contd)

Gas Chromatography

Gas Chromatography (contd)

This method was first described by James and Martein (1952), and has been developed very rapidly This is the best method for separation of biological compounds Advantages of GC:
Very good separation Time (analysis is short) Small sample is needed (picogram) Good detection system Quantitatively analyzed

Principles
(gas)

MOBILE PHASE

Sample in

Sample out

STATIONARY PHASE
(solid or heavy liquid coated onto a solid or support system)

Gas Chromatography (contd)

Gas chromatography (GC) is a preferred method, only applicable to volatile substances In GC mobile phase is gas, stationary phase could be: Solid Gas Solid Chomatography (GSC) Liquid Gas Liquid Chomatography (GLC) In GLC, solid support is coated a liquid

Gas Chromatography (contd)

Gas chromatography (GC) consists essentially of a gas supply, column and detector

Gas Chromatography (contd)

Gas supply consist of:
Cylinder of high purity gas under high pressure
Gas could be nitrogen, helium, etc.

Pressure regulation device Flow regulation device Flow measuring device

Column:
Glass/stainless steel Containing solid support (GSC) Solid support is coated a liquid (GLC)

Gas Chromatography (contd)

Detector is some device which generates a change in electrical signal in response to the solute as it comes off the column Most detectors require electronic amplification of the signal (electrometer) Kinds of detectors:
Flame ionization detector (FID) Nitrogen phosphorus detector (NPD) Electron capture detector (ECD) Flame photometric detector (FPD)

Schematic Diagram of Gas Chromatography

Instrumentation
Injection port sample introduction
Manual - Direct Injection Automated - Autosampler

Instrumentation (contd)
Oven Temperature Control
Isothermal Gradient

240 200

Temp (deg C)

160 120 80 40 0 0 10 20 30 Time (min) 40 50 60

Instrumentation (contd)
Column
Packed

Capillary

Instrumentation (contd)
Detector
Destructive
Mass Spectral (CI/EI) Flame Ionization (FID) Nitrogen-Phosphorus (NPD) Flame Photometric (FPD) Electrolytic Conductivity (Hall/ELCD)

Non-destructive
Thermal Conductivity (TCD) Electron Capture (ECD) Photo Ionization (PID)

Instrumentation (contd)
Detector
Biological detector
Gypsy moth to detect Gypsy moths hormone Human at the end of column detecting separated aromas

Normal detectors have been mentioned

Gas Chromatography Spectra

Application of GC and TLC

Application of GC and TLC

(contd)

 Terima kasih

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Sukarti Moeljopawiro
Biochemistry Laboratory Faculty of Biology

PCR
Polymerase Chain Reaction
Ditemukan oleh Kary Mullis (1984) Memperbanyak potongan DNA

SIKLUS PCR
PCR terdiri atas beberapa proses:
Pemanasan DNA untuk mendenaturasi DNA (memisahkan DNA menjadi 2 rantai tunggal) Penurunan suhu untuk penempelan primer oligonukleotida pada rantai DNA Polimerisasi karena adanya primer dan deoksiribonukleosida trifosfat serta adanya enzim Kemudian proses diulang lagi sampai 25 30 kali

Siklus PCR

DIAGRAM SIKLUS PCR

KEUNGGULAN PCR
Dapat menganalisis DNA yang sangat sedikit

Kemampuan amplifikasinya besar

Mampu memperbanyak DNA yang tidak segar/terdegradasi Spesifik, sederhana dan dapat menganalisis banyak sampel dengan cepat Mampu mendeteksi kelainan

KELEMAHAN PCR
Optimasi perlu waktu, kalau tidak optimum menyebabkan kesalahan interpretasi Karena sangat sensitif menyebabkan problem kontaminasi sangat tinggi terjadi kesalahan Kebersihan tanpa adanya kontaminasi dituntut sangat tinggi pada saat bekerja

TEKNIK PCR
BAHAN:
DNA Primers Enzim (Thermostable Polymerase) Empat macam deoksiribonukleosida trifosfat Ion Mg Buffer dan akuades

PROSES TERDIRI DARI:

Denaturasi Annealing Polimerisasi Kembali denaturasi

OPTIMASI PCR
Agar potongan DNA berhasil didapatkan dengan baik perlu optimasi:
Konsentrasi: enzim, dNTPs, Mg2+, primer Suhu dan waktu: annealing, denaturasi, polimerisasi/pemanjangan

Konsentrasi enzim
1 2,5 unit/100 l larutan reaksi namun tergantung dari template target dan primer. Masing-masing sampel perlu dioptimasi Konsentrasi untuk optimasi dianjurkan antara 0,5 5 unit/100 l

OPTIMASI PCR
Konsentrasi dNTPs

(lanjt.)

Stok dNTPs harus netral (pH 7), disimpan dengan konsentrasi 10 mM pada suhu 20C. Konsentrasi keempat macam deoksiribonukleosida trifosfat harus sama pada larutan dNTPs

Spesifitas dan ketelitian naik dengan rendahnya konsentrasi, sebab dengan konsentrasi yang rendah memperkecil kemungkinan terjadinya salah penempelan primer ( 20 M/100 l larutan reaksi).
Namun konsentrasi tersebut juga tergantung DNA yang diamplifikasi

OPTIMASI PCR
Konsentrasi Mg2+

(lanjt.)

Optimasi konsentrasi ion Mg sangat penting sebab konsentrasi ion Mg akan mempengaruhi: penempelan primer, suhu dissosiasi baik jalin DNA template maupun produk PCR, spesifitas produk, pembentukan primer-dimer, aktivitas enzim dan ketelitian Konsentrasi sebaiknya antara 0,5 2,5 mM

Konsentrasi primer
Konsentrasi primer dianjurkan antara 0,1 0,5 M. Semakin tinggi konsentrasi primer menyebabkan terjadinya salah tempel (mispriming) dan terjadi penumpukan produk yang tidak diinginkan, juga kemungkinan terjadi primer-dimer

OPTIMASI PCR

(lanjt.)

Rumus untuk mengirakan konsentrasi primer:

0,067 Y / OD260 = X
(Ruiz et al., 1997) Y : volume reaksi (l) X : volume primer yang akan dipakai (l) OD260 : optical density pada 260 nm

OPTIMASI PCR
Suhu annealing

(lanjt.)

Suhu yang diperlukan untuk annealing primer tergantung pada: komposisi basa, panjang dan konsentrasi DNA Suhu annealing terbaik biasanya 5C dibawah Tm. Biasanya suhu antara 50 72 C menghasilkan produk yang bagus Suhu terlalu tinggi menyebabkan penempelan primer tidak betul dan kesalahan perpanjangan pada ujung 3 primer, sehingga suhu annealing sangat kritis lebih-lebih pada tahap putaran permulaan

OPTIMASI PCR

(lanjt.)

Pemanjangan rantai (primer extension) Waktu pemanjangan tergantung pada panjang dan konsentrasi DNA yang diamplifikasi serta suhu Suhu pemanjangan umumnya 72 C Suhu 72 C selama 1 menit cukup untuk produk dengan panjang 2 kb Suhu dan waktu denaturasi Penyebab utama gagalnya reaksi PCR adalah tidak sempurnanya proses denaturasi Biasanya: 95 C selama 30 detik atau 97 C selama 15 detik Namun, lebih tinggi mungkin lebih baik terutama DNA yang banyak pasangan GC (Innes et al., 1990)

OPTIMASI PCR

(lanjt.)

Jika denaturasi tidak sempurna, mungkin DNA kembali berikatan ataupun tidak mampu menerima primer yang akan menempel, sehingga sensitifitas turun produk turun. Ini terjadi jika waktu denaturasi terlalu pendek. Jika waktu terlalu lama enzim polimerase akan rusak

Beberapa protokol menganjurkan denaturasi mula-mula 94 C selama 1 10 menit (Ruiz et al., 1997) (Innes et al., 1990) menyebutkan waktu paruh polimerase DNA kurang dari 2 jam untuk 92,5 C, 40 menit untuk suhu 95 C, dan 5 menit untuk suhu 97,5 C

OPTIMASI PCR

(lanjt.)

Jumlah putaran Jumlah tergantung pada konsentrasi DNA mulamula dengan catatan semua parameter sudah dioptimasi Amplifikasi lebih dari 40 putaran akan menghasilkan produk PCR yang salah Terlalu sedikit putaran akan mendapatkan produk yang sedikit Rekomendasi putaran vs konsentrasi mulamula:

Jumlah Molekul Awal 3 x 105 1,5 x 104 1 x 103 50

Jumlah Putaran 25 sampai 30 30 sampai 35 35 sampai 40 40 sampai 50

VERIFIKASI HASIL PCR

APLIKASI PCR UNTUK RAPD

Keunggulan RAPD Mudah, cepat, jumlah sampel DNA yang dibutuhkan sedikit Tidak memerlukan pengetahuan tentang sekuen DNA yang diteliti Tidak melibatkan radioaktif Analisis RAPD untuk identifikasi penanda genetik (linked dengan suatu sifat khususnya sifat yang sulit diamati secara morfologi/fenotip) Teknologi RAPD mempunyai prospek baik untuk mengidentifikasi penanda DNA terkait dengan jenis kelamin tanaman

KELEMAHAN METODE RAPD

Karena RAPD berdasarkan reaksi PCR maka optimasi komponen dan kondisi PCR sangat mempengaruhi hasil Sehingga metode RAPD menuntut kondisi optimal untuk mengembangkan protokol yang reproducible

PENGGUNAAN METODE RAPD

Pemetaan genetik Analisis filogenetik Penyusunan peta keterkaitan (linked) Evaluasi aliran gen antar jenis Identifikasi:
Individu Kultivar atau jenis dengan sidik jari genom Tetua dalam analisis silsilah

CONTOH PENGGUNAAN RAPD

Identifikasi penanda kelamin dengan metode RAPD untuk mendeteksi perbedaan molekular tanaman salak jantan dan betina pada tingkat DNA
(Parjanto, Disertasi UGM 2006)

CONTOH PENERAPAN RAPD

bp

600 400 300 -

Gambar 1. Pola pita RAPD tanaman salak (S. zalacca) jantan (J1-J5) dan betina (B1-B5) menggunakan primer OPA-11. Tanda panah menunjukkan fragmen DNA 360 bp hasil amplifikasi dengan OPA-11 (OPA-11360) tidak spesifik pada satu jenis kelamin. M = marker 100 bp.

CONTOH PENERAPAN RAPD

(lanjt.)
bp
- 1000 - 600 - 400

(Parjanto, Disertasi UGM 2006)

Gambar 2. Penanda RAPD (400 bp) spesifik pada tanaman salak (S. zalacca) jantan hasil amplifikasi dengan primer OPP-08 (OPP-08400). B = tanaman betina, J = tanaman jantan, M = marker 100 bp.

Terima Kasih