BAB III METODE PENELITIAN

A. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini akan dilaksanakan di laboratorium Progran Studi Biologi dan Kimia Undana Kupang pada bulan....2013.

B. Alat dan Bahan Penelitian Alat dan bahan yang dibutuhkan selama penelitian berlangsung adalah sebagai berikut: 1. Alat Alat-alat yang digunakan dalam laboratorium adalah mikroskop stereo lengkap dengan kamera, kaca benda dan kaca penutup, cawan petri, lup inokulasi, inkubator, laminar air flow, pipet ukur, mikro pipet, autoclave, pisau steril, sensidisc dispenser, wadah maserasi, colony counter, lampu spiritus, blender, pisau, gelas ukur, tabung reaksi, dan caliper.

2. Bahan Thalus rumput laut Eucheuma cottoni yang berpenyakit ice-ice, Callyspongia sp., etanol, tetrasikilin sebanyak 0,00030 gram, medium Mueller Hilton Agar (kalo habus ganti dengan NA), kapas steril, 1 set perwarnaan gram dan pewarnaan sederhana, minyak imersi, larutan water-iodin, aquades, dan air laut.

3. Desain Percobaan Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan apa? . Pengujian antibakeri dengan menggunakan metode difusi agar sebagai metode penelitian untuk menentukan uji resistensi isolat bakteri rumput laut yang berpenyakit ice-ice terhadap antibakteri etanol Callyspongia. Peneliian terdiri dari 4 perlakuan (isolat 1, 2, 3 dan 4) dan diulang sebanyka.......kali, jadi total unit perlkuan sebanyak........

C. Prosedur Kerja 1. Isolasi dan Karakterisasi Mikroorganisme dari Rumput Laut yang Berpenyakit Ice-ice (kalau pakai dr PGRI maka langkah ini tidak perlu, ganti dengan peremjaan bakteri isolat stok, cari prosedur),

Talus rumput laut yang berpenyakit ice-ice ditimbang sebanyak 10 gram dengan neraca analitik, kemudian dibilas dengan aquades steril. Selanjutnya dipotong-potong dengan pisau steril dan dimasukkan dalam blender untuk dihancurkan samapai membentuk suspensi. Suspensi diencerkan hingga dengan cara memipet 1 ml suspensi asal

dan dipindahkan ke tabung reaksi yang telah didisi 9 ml air laut steril untuk pengenceran . Dari pengenceran dipipet lagi sebanyak 1 ml dan

dmasukkan ke tabung reaksi berikutnya yang telag diisi dengan 9 ml air laut steril. Cara yang sama dilakukan secara berulang-ulang untuk mendapatkan pengenceran . Dari pengenceran dipipet sebnyak 1 ml dan

masing-masing ditanam dalam medium NA (dalam pembuatan medium ini aquades diganti dengan air laut) dengan teknik pour plate. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 selama 24 jam. Setelah inkubasi, koloni yang tumbuh pada tiga

seri pengenceran dihitung jumlahnya. Jumlah koloni yang tumbuh di bawah 30 dan di atas 300 harus dilakukan ulang. Koloni yang tumbuh diamati morfologi koloni, terdiri dari tepi, bentuk, elavasi dan warna. Koloni-koloni dengan penampilan yang berbeda dipilih dan diisolasi dengan tekhnik streak plate dalam medium NA. Medium yang telah digores dengan inokulum diinkubasi pada sushu 37 . Koloni yang tumbuh

terpisah diamati dan disesuaikan dengan karakteristik koloni asal. Koloni yang memperlihatkan karakteristik yang sama akan diisolasi dan di tanam dalam medium NA miring sebagai isolat stok untuk pengamatan

karakteristik morfologi sel. Selanjutnya dilakukan pewarnaan cepat dengan

metylen blue. Di samping itu dilakukan pewarnaan gram untuk seleksi gram positif dan negatif.

2. Pembuatan ekstrak etanol Callyspongia sp. Callyspongia sp. Yang sudah dikeringkan, dipotong kecil-kecil dan dihaluskan. Selanjutnya ditimbang sebanyak 100 gram gram, kemudian dimasukkan ke dalam wadah maserasi dan ditambah pelarut etanol sebanyak 350 ml (agar bahan yang diekstraksi terendam semua sehingga dapat terjadi ekstraksi sempurna), didiamkan selama 5 hari sambil sekali-sekali diaduk. Selanjutnya disaring dan ekstrak yang diperoleh ditampung dan dipekatkan sampai kental dengan vacuum evaporator.

3. Pembuatan larutan antimikroba Ekstrak Callyspongia sp. Ditimbang 2.0 gram dan dilarutkan dalam aquades steril hingga volumenya mencapai 10 ml hingga diperoleh larutan antimikroba dengan konsentrasi 20%. (Perlakuanya menggunakan tipe isolat, maka gunakan minimal 4 isolat, hanya satu konsentrasi saja, yakni 50%)

4. Pembuatan larutan pembanding Tetrasiklin ditimbang sebanyak 0,00030 gram dan dilarutkan dalam aquades steril hingga volumenya mencapai 10 ml, sehingga diperoleh konsentrasi 30 .

5. Pengujian Resistensi Isolat Bakteri dari rumput laut yang berpenyakit Ice-ice Resistensi bakteri dilihat dari diameter zona hambat. Penentuan resistensi isolat berdasarkan Cappucino dan Sherman (1983) dan Prescot et al. Dalam Tokan (2006). Medium Mueller Hilton Agar sebanyak 10 ml dituang secara aseptik ke dalam cawan petri dan dibiarkan hingga beku sebagai lapisan dasar. Sebanyak 5 ml medium Mueller Hilton Agar yang agak dingin dengan suhu 45-48 , setelah dicampur rata dengan isolat bakteri dari rumput laut

yangberpenyakit ice-ice dengan cara dituang dia atas lapisan dasar medium dan disebarkan secara rata dengan speader steril. Selanjutnya sensi-disc atau pecandangdiletakan di atas permukaan medium dan masing-masing disi dengan 0.2 ml larutan pembanding atau larutan uji. Untuk satu medium per satu jenis isolat terdiri dari 3 pecandang yang terbagi menjadi 1 kontrol positif berisi tetrasiklin, 1 kontrol negatif dan 1 pecandang yang berisi ekstrak zat antimikroba Callyspongia sp. Isolat diinkubasi pada suhu 37 diameter zona penghambat diukur dengan caliper. selama 24 jam. Selanjutnya

D. Variabel Penelitian (lihat engel) Variabel bebas : Konsentrasi antibakteri Callyspongia (Tipe isolat, isolat 1, 2, 3, dan 4) Variabel terikat : Diameter zona hambat Variabel Kontrol : Medium NA, suhu dan waktu inkubasi serta volume ekstrak antibakteri Callyspongia.

E. Pengumpulan dan Analisis Data Data yang dikumpulkan dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat dari masing-masing isolat bakteri rumput laut yang berpenyakit ice-ice yang diberikan antibakteri Callyspongia. Data diameter zona penghambat ini dianalisis secara statistik dengan One Way Anova, bila terdapat pengaruh dilanjutkan dengan uji beda nyata jujur (BNJ) cara tukay pada taraf signifikansi 5%.

F. Interprestasi Hasil Analisis Untuk menerima dan menolak kesimpulan yang diajukan pada Bab 1, sebagai berikut: jika F hitung > F tabel, maka H1 diterima dan jika sebaliknya maka H1 ditolak.