IDENTIFICATION OF EXCRETION – SECRETION PROTEIN PROFILE OF THE ADULT Haemonchus contortus WITH SDS-PAGE Artha Rini Pasila

Mahasiswa, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya ABSTRACT The aim of this research is to identify excretion – secretion protein (ESP) profile of Haemonchus contortus which presented in mollecular weight. One hundred female Haemonchus contortus were isolated from sheeps and goats’ abomasum from Surabaya Slaughter House, worms were washed by Phosphat Buffer Saline (PBS) then incubated in PBS with pH 7,0 and temperature 37°C for a night. Excretion – secretion liquid that worms produced in PBS isolated with saturated ammonium, then SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamid Gel Electrophorese) method used to identified excretion – secretion protein profile. Result of this research got 5 excretion – secretion protein profile : 42,3 kilo Dalton (kDa); 39,3 kDa; 28,9 kDa; 24,4 kDa and 13,9 kDa. Key words : Haemonchus contortus, ESP, SDS-PAGE

wol dan terhambatnya pertumbuhan domba muda baik secara kualitatif maupun kuantitatif serta kematian domba. sehingga harus ditetaskan dan larva dibiarkan berkembang sampai larva stadium ke-3 yang infektif kemudian diidentifikasi (Levine.. Berdasarkan masalah di atas. 2001) dan ekskresi-sekresi untuk pengembangan vaksin. 1999). harga relatif murah. 2000). wol dan kulit sebagai komoditi ekspor yang cukup berharga. Parasit dianggap sebagai penghambat dalam pembangunan peternakan. contortus dewasa (Lastuti dkk. penurunan produksi susu. 1992. Ostertagia sp dan Trichostrongylus sp mirip sekali satu sama lain. mencegah pencemaran pakan dan minuman dari tinja dan menyediakan tempat yang telah didesinfeksi atau padang rumput yang tidak terinfeksi H. protein dari intestin H. contortus untuk melahirkan (Levine. Pengendalian dapat juga ditempuh dengan memberikan pengobatan menggunakan antelmintik yang tepat. Pengembangan ternak domba dilaksanakan dengan meningkatkan populasi dan produktivitas domba diimbangi sistem pemeliharaan yang baik serta pengendalian dan pemberantasan penyakit. 1998). khususnya gangguan endoparasit. kemudahan cara pemakaian. Semakin besar molekul protein eskresi-sekresi.PENDAHULUAN Ruminansia kecil khususnya domba sangat potensial untuk dikembangkan karena selain sebagai sumber protein hewani yang baik. seperti antigen somatik (El-Massry. contortus dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa yang merupakan protein yang sangat imunogenik (Kodyman et al. Haemonchosis dapat didiagnosis dengan menemukan cacing pada saat bedah bangkai atau menemukan telur cacing pada saat pemeriksaan tinja. semakin besar kemungkinan protein tersebut imunogenik (Tizard.p. cepat berkembang biak serta dapat menghasilkan pupuk. daging. kualitas kulit. 1990). murah serta efek samping minimal. contortus per gram tinja induk semang sampai batas patogen yaitu 300 butir telur per gram tinja (t. penelitian ini bertujuan mengetahui profil protein dari cacing Haemonchus . tetapi hal ini sulit dilakukan karena telur Haemonchus sp. 1987). contortus memiliki berat molekul tertentu. 1990). 2000). menimbulkan kerugian ekonomi yaitu penurunan berat badan. Banyak penelitian yang mengarah ke pembuatan vaksin molekuler untuk mengantisipasi problem yang ditimbulkan oleh cacing dengan menggunakan antigen dari produk cacing. Profil protein ekskresi-sekresi H. Pemberian antelmintik untuk mengendalikan infeksi cacing harus memperhatikan efektivitas dan spektrum. Pengendalian haemonchosis dapat dilakukan dengan menekan jumlah arva infektif melalui pengeringan lapangan tempat domba merumput. Abdel-Rahman and Megeed. Haemonchosis merupakan penyakit parasiter yang paling sering menyerang domba.g) serta melakukan pencegahan yaitu menyapih anak domba seawal mungkin karena domba dewasa merupakan sumber infeksi bagi domba muda. Disebabkan oleh cacing Haemonchus contortus. melakukan penghitungan telur H. seperti penggunaan antigen dari hasil ekskresisekresi H. terutama yang berhubungan dengan peningkatan populasi dan produksi ternak (Koswara. antigen dari ekstrak cacing dewasa (Safar et al.

Setelah pita protein terlihat maka dapat dihentikan dengan penambahan asam asetat 10%. Cacing diinkubasi dalam PBS pada cawan petri dengan temperatur 37°C dan pH 7. kemudian diberikan larutan pengembang warna. cacing dibedakan dengan melihat adanya intestin dan uterus yang berselangseling. Hasil gel yang telah tampak disimpan dalam larutan gliserol 10% (Axelsen.0 selama semalam. METODE PENELITIAN Isolasi dan Kultivasi H. gel dimasukkan ke larutan pencuci yang terdiri dari empat tahap pencucian. dengan suhu 4°C. contortus dewasa. dimasukkan ke dalam lubang pada stacking gel yang tersedia dan dilakukan running dengan 100 volt. Setelah dicuci gel diwarnai dengan AgNO3 selama 15 menit sambil digoyang. Penghitungan berat molekul dilakukan dengan membandingkan standart marker. setelah mengeras pada bagian atasnya dimasukkan stacking gel yang telah dipersiapkan. Pelet yang didapatkan kemudian diresuspensi dengan PBS dan siap untuk identifikasi protein. Isolasi Protein Ekskresi-Sekresi Protein ekskresi-sekresi yang terdapat dalam PBS hasil kultivasi cacing diisolasi dengan penambahan amonium jenuh kemudian dicampur sampai rata dan diinkubasi pada suhu 4°C selama semalam. kemudian dilakukan pencucian dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali selama dua menit. 1987 yang sudah dimodifikasi). Setelah running. contortus invitro Seratus ekor cacing H. Sebanyak 10 μl sampel protein ditambah laemmli buffer dengan perbandingan 2:1 kemudian dilakukan perebusan pada 100°C selama lima menit. Setelah perebusan. contortus betina dewasa dalam keadaan hidup diisolasi dari abomasum domba dan kambing yang dipotong di RPH Surabaya. 1983 yang sudah dimodifikasi. kemudian dilakukan pencucian dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) sampai bersih.contortus dewasa berdasarkan berat molekul protein ekskresi-sekresi cacing H. Elektroforesis Protein Ekskresi Sekresi dengan SDS-PAGE Bahan disiapkan kemudian dibuat running gel dan dimasukkan ke dalam plat kaca. kemudian dicuci dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali.000 rpm selama 10 menit. Cairan ekskresi maupun sekresi. kemudian dilakukan sentrifugasi 10. Meyer and Walker. yaitu cairan yang dikeluarkan cacing sebagai sisa metabolisme dalam PBS diambil untuk isolasi protein ekskresisekresi. 40 mA pada chamber yang telah diisi Electrode Buffer 1x. .

contortus dengan Menggunakan SDS-PAGE 12 % Rf = Jarak band dari sumuran / Panjang gel sesudah di running ∗ Marker : Panjang gel sesudah di running = 12 1.4 kDa 5.66 ml Tris HCl pH 6.48 Dari data marker.5 % 1.28 4.14 3.0 μl APS 10 % 30 μl 3.7 mM (0.679 X Hasil : 1.1/12 = 0.5 kDa Rf = 7.48 ∗ Sumuran I : 1.80 ml SDS 0.2 ml Aquades 1.Perhitungan Fraksi Protein Ekskresi Sekresi H.5 % 0. 24.34 5. 39.766 .80 ml Aquades 0.28 4.80 ml .4/12 = 0.10 2.25/12 = 0. Komposisi Phosphat Buffer Saline (PBS) NaCl 13. Rf = 4.85/12 = 0.3 kDa Rf = 5.10 2.12 3.9 kDa Komposisi Bahan-Bahan Yang Digunakan Dalam Penelitian 1.74. Rf = 3.34 5.7 mM (8 g) KCl 2.42 g) Aquades ad 1000 ml 2.3 kDa 3. Protein 6.766 + (–) 74. 13.2 ml SDS 0.8 0.1 kDa Rf = 4.2 /12 = 0.5 ml Tris HCl pH 8. Protein 45 kDa Rf = 0. Protein 14.3 kDa 2.2 g) Na2HPO4 x 2H2O 8 mM (1.25/12 = 0. 28. Rf = 1.7/12 = 0.1 ml Temed 5. Protein 20. dibuat persamaan linier dimana koefisien X = Rf marker dan Y = Protein marker (kDa) ⇒ didapatkan persamaan : Y = 49. Rf = 1.7 /12 = 0.9 kDa 4. Protein 30 kDa Rf = 3. Komposisi Running Gel 12 % Acrilamid 2.679 X Y = 49. Rf = 5.8/12 = 0. 42.2/12 = 0.8 1. Komposisi Stacking Gel 12 % Acrilamid 0.

Menunggu hingga sampel turun seluruhnya 14.25 ml Diletakkan di atas shaker dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit  Pencucian II: Metanol 25 ml Asam asetat 3. Menyiapkan sampel (Laemmli Buffer + sampel) dimasukkan ke dalam eppendorf dan direbus dengan suhu 100 0C selama 5 menit 8.75 ml Aquades 93.75 ml Digoyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit .Temed 4. Komposisi Pengembang Warna Formaldehid 3.13 g SDS CH12H2SO4 10 g Aquades ad 1000 ml 5. Membuat running gel 12 % (komposisi lengkap pada lampiran 2). Memasang listrik dengan tegangan 125 V dan 40 mA (proses running) 13.29 g Glisin 144. Menambahkan butanol 5. Komposisi Electrophoresis Buffer Tris (hidroksimetil) aminomethan 30.4 ml AgNo3 dilarutkan dalam 4 ml Aquades 6. Memasukkan cetakan ke Bio Rad 10. Membuat stacking gel 12 % (komposisi pada lampiran 2) 6. 3. Memasukkan running gel lewat dinding kaca hingga mencapai 1 cm dari atas 4. Memasukkan agar ke dalam cawan petri yang telah berisi larutan pencuci 16.0 μl APS 10 % 20 μl 4. Semua bahan yang diperlukan disiapkan. Tahap pencucian:  Pencucian I: Metanol 25 ml Asam asetat 3. Komposisi Pewarnaan Perak Aquades 73. Mematikan listrik dan melepas agar pelan-pelan 15.75 ml Aquades 71. 2.36 % 21 ml NH3 1. melepaskan comb dan cuci dengan E Buffer 1 kali 9.7 % 50 μl Asam sitrat 5 % 100 μl Aquades 100 ml Cara Kerja SDS-PAGE 1. Dituangi dengan E Buffer (kira-kira 800 ml) 11. Setelah inkubasi selesai. Memasukkan stacking gel ke atas cetakan running gel hingga penuh kemudian memasukkan comb ke atas stacking gel dan diinkubasi selama 25 menit 7. Memasukkan sampel ke dalam lubang comb dan menghilangkan gelembung udara dengan jarum 12.5 ml NaOH 0.

sederhana. 28.Pencucian III: Glutaraldehid 10 ml Aquades 90 ml  Pencucian IV: aquades @ 100 ml 3 kali selama 30 menit 17.9 kDa. Elektroforesis dengan Acrylamid (PAGE) merupakan metode standar untuk memisahkan. Prinsip dasar SDSPAGE ini adalah denaturasi protein oleh sodium dodecyl sulphate yang dilanjutkan dengan pemisahan molekul berdasarkan berat molekulnya dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel.3 kDa. Teknik ini biasa digunakan karena murah. identifikasi. 39.4 kDa dan 13. Menghentikan reaksi dengan menambahkan asam asetat 10 % 21. dalam hal ini digunakan polyacrylamide. karakterisasi dan purifikasi molekul DNA/RNA (Artama. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 1.9 kDa. Memasukkan pengembang warna (komposisi pada lampiran 2) dan goyangkan selama 5 menit 20. Menambahkan gliserol 10 % (Gliserol 10 ml + aquades 90 ml)  HASIL DAN PEMBAHASAN Berdasarkan hasil penelitian dengan elektroforesis dari ekskresi-sekresi cacing Haemonchus contortus dengan metode SDS-PAGE didapatkan 5 profil protein dengan berat molekul yaitu: 42. 1991).3 kDa. Tahap Pewarnaan Memasukkan komposisi pewarnaan perak (lampiran 2) dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 15 menit 18. Pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE bertujuan untuk memisahkan protein dalam sampel berdasarkan berat molekul. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 19. . sampel yang digunakan relatif sedikit dan lokasi DNA dapat langsung diamati dengan menggunakan perak nitrat sebagai zat warna. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 22. 24.

semakin imunogenik tetapi tidak menutup kemungkinan protein dengan berat molekul kecil dapat bertindak sebagai imunogen.9 kDa. 9 kDa. 9 kDa. Biasanya semakin besar berat molekulnya.3 kDa.6 kDa. Profil protein yang dominan adalah 19. 11.4 kDa dan 13. 4 kDa. 39. yaitu: 42.9 kDa.4 kDa.9 kDa.6 kDa.Zat lain yang digunakan adalah Temed sebagai inisiator terjadinya polimerisasi dan amonium persulfat (APS) sebagai katalisator. 41.9 kDa dan 24. 4 kDa. 1987). Dari lima profil protein tersebut. Dari kelima profil protein tersebut.4 kDa. buffer bertujuan untuk menghantarkan listrik agar cairan sampel dapat turun ke dasar plate. Kodyman (2000) menyatakan bahwa antigen yang mengandung protein dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa merupakan antigen yang sangat imunogenik. dimana tebal tipisnya pita protein yang tercat merupakan gambaran banyaknya protein yang terkandung dalam profil protein ekskresi-sekresi.9 kDa. Pemberian asam asetat diperlukan untuk menghentikan reaksi agar pewarnaan tidak terlalu gelap sehingga dapat terbaca. 27. 24 kDa. contortus. 3.9 kDa.4 kDa adalah profil yang tercat tebal.4 kDa.9 kDa dan 24.4 kDa. 19. didapatkan dua profil yang tercat tebal yaitu protein dengan berat molekul 28. 7 kDa.3 kDa.6 kDa.6 kDa. makin tinggi konsentrasi gel maka pori yang terbentuk semakin kecil. Pencucian dengan E. Pemilihan konsentrasi gel yang tepat juga menentukan keberhasilan pemisahan fraksi protein karena menentukan besar poripori matriks gel. 14.8 kDa dan 3. yaitu: 46 kDa.3 kDa. Dari hasil penelitian tersebut dapat dikatakan bahwa kemungkinan profil protein 24 kDa berasal dari intestin H.8 kDa dan 3. 39. 24. didapatkan 13 profil protein. contortus dewasa. sehingga dalam penelitian ini protein yang memiliki berat molekul 13. sedangkan pemakaian APS yang terlalu sedikit dapat memperlambat reaksi sehingga polimerasi akan berjalan lambat. 28. . Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Lastuti dkk (2001) terhadap intestin H. 11.9 kDa dan 24. Hasil elektroforesis dengan metode SDS-PAGE didapatkan beberapa profil protein ekskresi-sekresi H. walaupun molekul besar jauh lebih baik (Tizard. yang dapat digunakan sebagai dasar pengembangan reagen diagnostik dan terapi masih perlu penelitian lebih lanjut. Dari beberapa profil protein ekskresi-sekresi yang didapatkan dalam penelitian ini. Pemakaian Laemmli buffer dalam penelitian ini bertujuan agar fraksi protein saat dirunning dapat terpisah dengan sempurna. 28. 3.3 kDa.2 kDa. Pemberian Temed dan APS harus disesuaikan dengan kebutuhan karena apabila terlalu banyak dapat menyebabkan protein teroksidasi dan perubahan pada buffer.4 kDa dan 13. 24. contortus.9 kDa. 14. 36 kDa. KESIMPULAN Berdasarkan hasil identifikasi protein ekskresi-sekresi Haemonchus contortus dengan SDS-PAGE didapatkan lima profil protein yaitu: 42. profil protein dengan berat molekul 28.4 kDa kemungkinan besar adalah protein yang sangat imunogenik sehingga dapat digunakan sebagai bahan diagnosa dan terapi haemonchosis.

..S. Dr.. drh. drh.S. drh. Fedik Abdul antam. selaku koordinator Bagian Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.. Ismudiono. M. Dr. selaku pembimbing pertama dan Tri Nurhajati.. selaku pembimbing kedua. drh. selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.S. Nunuk Dyah Retno L.UCAPAN TERIMA KASIH Prof. M. M.

PAU – Bioteknologi Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. Parasitologi Veteriner. Abdel-Megeed. 1987. E. Protein Chromatographyc Study on Adult Ascaris lumbricoides. 1992. M. Meyer. J. F. Wayan. A. . Soc. Prosiding Seminar Parasitologi Nasional IV. Blackwell Scientific Publications. Ascaris vitulorum and Toxocara canis.. Diterjemahkan oleh Gatot Ashadi. Egyp. 29 (2): 335-345 Kodyman. Artama. Soc. contortus Dewasa. Lemlit. R. B. J. F. S. H. J and J. 1999. Yogyakarta. McKellar and J. 1-95. Academic Press Inc. D. El-Massry. Parasite. N. Rekayasa Genetika. Koswara. and K. 1987. Jan. Abstrak. A. Saunders Company. Characterization of Antigenic Property of Toxocara canis and Toxocara leonine Adults and Larvae Through Immunodiagnostic Electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot Technique. 1990. 39-44. Tizard. Aksono. 1983. E. N. Egyp. Parasitol. W. Australia. contortus Antigens is Age Related and Corellates with IgE Rather than IgG1 Antibody. Mufasirin dan B. R. 22 (1): 171-176. D. Maklad. Perkumpulan Pemberantasan Penyakit Parasit Indonesia. 1991. 1998. An Introduction of Veterinary Immunology. Immunochemical Methods in Cell and Mollecular Biology. Mollecular Identity of Major Cross Reactive Adult Antigens in Fasciola gigantica. T. El-Rifaei and K. A. Universitas Airlangga. Huntley. Axelsen. Safar... Surabaya. Vanleuwen. Handbook of Immunoprecipitation in Gel Techniques. O. Immunol. N. Parasitol. Walker. Jakarta. Peran Serta Masyarakat Dalam Upaya Pengendalian Penyakit Parasitik Pada Hewan. 214. 2001. Lastuti. M. Parasitol. Profil Protein Intestine H. Soc. H. R. 417-424. 2000.DAFTAR PUSTAKA Abdel-Rahman. Protection in Lambs Vaccinated with H. H. I.. Toxocara vitulorum and Moniezia expansa. 22 (1): 13-20. H. N. J. Gajah Mada University Press. 30 (2): 561-571. Scalling. 254-257. H. 2000. Harcourtbrace Jovanich Publisher. Egyp.. Levine.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful