IDENTIFICATION OF EXCRETION – SECRETION PROTEIN PROFILE OF THE ADULT Haemonchus contortus WITH SDS-PAGE Artha Rini Pasila

Mahasiswa, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya ABSTRACT The aim of this research is to identify excretion – secretion protein (ESP) profile of Haemonchus contortus which presented in mollecular weight. One hundred female Haemonchus contortus were isolated from sheeps and goats’ abomasum from Surabaya Slaughter House, worms were washed by Phosphat Buffer Saline (PBS) then incubated in PBS with pH 7,0 and temperature 37°C for a night. Excretion – secretion liquid that worms produced in PBS isolated with saturated ammonium, then SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamid Gel Electrophorese) method used to identified excretion – secretion protein profile. Result of this research got 5 excretion – secretion protein profile : 42,3 kilo Dalton (kDa); 39,3 kDa; 28,9 kDa; 24,4 kDa and 13,9 kDa. Key words : Haemonchus contortus, ESP, SDS-PAGE

sehingga harus ditetaskan dan larva dibiarkan berkembang sampai larva stadium ke-3 yang infektif kemudian diidentifikasi (Levine. contortus per gram tinja induk semang sampai batas patogen yaitu 300 butir telur per gram tinja (t. seperti penggunaan antigen dari hasil ekskresisekresi H. harga relatif murah. penelitian ini bertujuan mengetahui profil protein dari cacing Haemonchus . 1998). contortus dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa yang merupakan protein yang sangat imunogenik (Kodyman et al. tetapi hal ini sulit dilakukan karena telur Haemonchus sp. cepat berkembang biak serta dapat menghasilkan pupuk. Haemonchosis merupakan penyakit parasiter yang paling sering menyerang domba. wol dan kulit sebagai komoditi ekspor yang cukup berharga. murah serta efek samping minimal. khususnya gangguan endoparasit. antigen dari ekstrak cacing dewasa (Safar et al. menimbulkan kerugian ekonomi yaitu penurunan berat badan. contortus memiliki berat molekul tertentu. Profil protein ekskresi-sekresi H. seperti antigen somatik (El-Massry. Pengendalian dapat juga ditempuh dengan memberikan pengobatan menggunakan antelmintik yang tepat.g) serta melakukan pencegahan yaitu menyapih anak domba seawal mungkin karena domba dewasa merupakan sumber infeksi bagi domba muda. Abdel-Rahman and Megeed. contortus untuk melahirkan (Levine. 2000). wol dan terhambatnya pertumbuhan domba muda baik secara kualitatif maupun kuantitatif serta kematian domba. 2001) dan ekskresi-sekresi untuk pengembangan vaksin. Pengembangan ternak domba dilaksanakan dengan meningkatkan populasi dan produktivitas domba diimbangi sistem pemeliharaan yang baik serta pengendalian dan pemberantasan penyakit. protein dari intestin H. Semakin besar molekul protein eskresi-sekresi. Disebabkan oleh cacing Haemonchus contortus. penurunan produksi susu. semakin besar kemungkinan protein tersebut imunogenik (Tizard. Berdasarkan masalah di atas. Pengendalian haemonchosis dapat dilakukan dengan menekan jumlah arva infektif melalui pengeringan lapangan tempat domba merumput. Banyak penelitian yang mengarah ke pembuatan vaksin molekuler untuk mengantisipasi problem yang ditimbulkan oleh cacing dengan menggunakan antigen dari produk cacing. terutama yang berhubungan dengan peningkatan populasi dan produksi ternak (Koswara. kualitas kulit. 1992. daging. 1999). Ostertagia sp dan Trichostrongylus sp mirip sekali satu sama lain. 1987). 1990). melakukan penghitungan telur H. Haemonchosis dapat didiagnosis dengan menemukan cacing pada saat bedah bangkai atau menemukan telur cacing pada saat pemeriksaan tinja. Parasit dianggap sebagai penghambat dalam pembangunan peternakan. mencegah pencemaran pakan dan minuman dari tinja dan menyediakan tempat yang telah didesinfeksi atau padang rumput yang tidak terinfeksi H. Pemberian antelmintik untuk mengendalikan infeksi cacing harus memperhatikan efektivitas dan spektrum.PENDAHULUAN Ruminansia kecil khususnya domba sangat potensial untuk dikembangkan karena selain sebagai sumber protein hewani yang baik. 1990). kemudahan cara pemakaian. 2000). contortus dewasa (Lastuti dkk..p.

yaitu cairan yang dikeluarkan cacing sebagai sisa metabolisme dalam PBS diambil untuk isolasi protein ekskresisekresi. 1987 yang sudah dimodifikasi). dimasukkan ke dalam lubang pada stacking gel yang tersedia dan dilakukan running dengan 100 volt. contortus invitro Seratus ekor cacing H. kemudian dilakukan pencucian dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) sampai bersih. 40 mA pada chamber yang telah diisi Electrode Buffer 1x. Penghitungan berat molekul dilakukan dengan membandingkan standart marker. Elektroforesis Protein Ekskresi Sekresi dengan SDS-PAGE Bahan disiapkan kemudian dibuat running gel dan dimasukkan ke dalam plat kaca. Setelah dicuci gel diwarnai dengan AgNO3 selama 15 menit sambil digoyang. gel dimasukkan ke larutan pencuci yang terdiri dari empat tahap pencucian. setelah mengeras pada bagian atasnya dimasukkan stacking gel yang telah dipersiapkan. Isolasi Protein Ekskresi-Sekresi Protein ekskresi-sekresi yang terdapat dalam PBS hasil kultivasi cacing diisolasi dengan penambahan amonium jenuh kemudian dicampur sampai rata dan diinkubasi pada suhu 4°C selama semalam.contortus dewasa berdasarkan berat molekul protein ekskresi-sekresi cacing H. 1983 yang sudah dimodifikasi. kemudian diberikan larutan pengembang warna. Cairan ekskresi maupun sekresi. dengan suhu 4°C. kemudian dicuci dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali.0 selama semalam. kemudian dilakukan sentrifugasi 10. Sebanyak 10 μl sampel protein ditambah laemmli buffer dengan perbandingan 2:1 kemudian dilakukan perebusan pada 100°C selama lima menit. contortus betina dewasa dalam keadaan hidup diisolasi dari abomasum domba dan kambing yang dipotong di RPH Surabaya. kemudian dilakukan pencucian dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali selama dua menit. METODE PENELITIAN Isolasi dan Kultivasi H.000 rpm selama 10 menit. Setelah running. Meyer and Walker. Hasil gel yang telah tampak disimpan dalam larutan gliserol 10% (Axelsen. Cacing diinkubasi dalam PBS pada cawan petri dengan temperatur 37°C dan pH 7. cacing dibedakan dengan melihat adanya intestin dan uterus yang berselangseling. Setelah pita protein terlihat maka dapat dihentikan dengan penambahan asam asetat 10%. Setelah perebusan. contortus dewasa. Pelet yang didapatkan kemudian diresuspensi dengan PBS dan siap untuk identifikasi protein. .

dibuat persamaan linier dimana koefisien X = Rf marker dan Y = Protein marker (kDa) ⇒ didapatkan persamaan : Y = 49.766 .2 ml SDS 0. Rf = 3.5 % 0.7 /12 = 0.4/12 = 0.679 X Hasil : 1.8 0.34 5. Komposisi Stacking Gel 12 % Acrilamid 0.1/12 = 0. 24. 28.25/12 = 0. Protein 14.42 g) Aquades ad 1000 ml 2.3 kDa Rf = 5.9 kDa Komposisi Bahan-Bahan Yang Digunakan Dalam Penelitian 1. Protein 45 kDa Rf = 0.14 3.10 2.85/12 = 0.4 kDa 5.80 ml SDS 0.2 /12 = 0. 13. Protein 30 kDa Rf = 3.28 4. 39.12 3.48 ∗ Sumuran I : 1.5 ml Tris HCl pH 8.80 ml .74.1 kDa Rf = 4.Perhitungan Fraksi Protein Ekskresi Sekresi H. Rf = 1.2 ml Aquades 1.7/12 = 0.7 mM (0.5 kDa Rf = 7. 42.80 ml Aquades 0.1 ml Temed 5. Rf = 1.25/12 = 0.28 4. Protein 6.34 5. contortus dengan Menggunakan SDS-PAGE 12 % Rf = Jarak band dari sumuran / Panjang gel sesudah di running ∗ Marker : Panjang gel sesudah di running = 12 1. Komposisi Phosphat Buffer Saline (PBS) NaCl 13.7 mM (8 g) KCl 2. Protein 20.766 + (–) 74.2 g) Na2HPO4 x 2H2O 8 mM (1.9 kDa 4. Komposisi Running Gel 12 % Acrilamid 2.3 kDa 3.0 μl APS 10 % 30 μl 3.48 Dari data marker.5 % 1.66 ml Tris HCl pH 6.3 kDa 2.10 2. Rf = 4.2/12 = 0.8 1.8/12 = 0. Rf = 5.679 X Y = 49.

Semua bahan yang diperlukan disiapkan. 3.75 ml Digoyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit . Membuat running gel 12 % (komposisi lengkap pada lampiran 2). Mematikan listrik dan melepas agar pelan-pelan 15. 2.13 g SDS CH12H2SO4 10 g Aquades ad 1000 ml 5. Komposisi Pengembang Warna Formaldehid 3. Memasukkan agar ke dalam cawan petri yang telah berisi larutan pencuci 16.75 ml Aquades 93. Setelah inkubasi selesai. Memasukkan stacking gel ke atas cetakan running gel hingga penuh kemudian memasukkan comb ke atas stacking gel dan diinkubasi selama 25 menit 7. Menunggu hingga sampel turun seluruhnya 14.5 ml NaOH 0. Membuat stacking gel 12 % (komposisi pada lampiran 2) 6.4 ml AgNo3 dilarutkan dalam 4 ml Aquades 6.Temed 4. Menambahkan butanol 5.25 ml Diletakkan di atas shaker dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit  Pencucian II: Metanol 25 ml Asam asetat 3. Tahap pencucian:  Pencucian I: Metanol 25 ml Asam asetat 3. Memasang listrik dengan tegangan 125 V dan 40 mA (proses running) 13. Memasukkan cetakan ke Bio Rad 10. Dituangi dengan E Buffer (kira-kira 800 ml) 11. Komposisi Pewarnaan Perak Aquades 73. Memasukkan sampel ke dalam lubang comb dan menghilangkan gelembung udara dengan jarum 12.75 ml Aquades 71.29 g Glisin 144. melepaskan comb dan cuci dengan E Buffer 1 kali 9.0 μl APS 10 % 20 μl 4. Memasukkan running gel lewat dinding kaca hingga mencapai 1 cm dari atas 4.36 % 21 ml NH3 1.7 % 50 μl Asam sitrat 5 % 100 μl Aquades 100 ml Cara Kerja SDS-PAGE 1. Komposisi Electrophoresis Buffer Tris (hidroksimetil) aminomethan 30. Menyiapkan sampel (Laemmli Buffer + sampel) dimasukkan ke dalam eppendorf dan direbus dengan suhu 100 0C selama 5 menit 8.

Menghentikan reaksi dengan menambahkan asam asetat 10 % 21. Teknik ini biasa digunakan karena murah. Pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE bertujuan untuk memisahkan protein dalam sampel berdasarkan berat molekul. sederhana. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 19. Prinsip dasar SDSPAGE ini adalah denaturasi protein oleh sodium dodecyl sulphate yang dilanjutkan dengan pemisahan molekul berdasarkan berat molekulnya dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel. 39. identifikasi. karakterisasi dan purifikasi molekul DNA/RNA (Artama. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 22.3 kDa.Pencucian III: Glutaraldehid 10 ml Aquades 90 ml  Pencucian IV: aquades @ 100 ml 3 kali selama 30 menit 17. Memasukkan pengembang warna (komposisi pada lampiran 2) dan goyangkan selama 5 menit 20. dalam hal ini digunakan polyacrylamide. 24. Tahap Pewarnaan Memasukkan komposisi pewarnaan perak (lampiran 2) dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 15 menit 18. Menambahkan gliserol 10 % (Gliserol 10 ml + aquades 90 ml)  HASIL DAN PEMBAHASAN Berdasarkan hasil penelitian dengan elektroforesis dari ekskresi-sekresi cacing Haemonchus contortus dengan metode SDS-PAGE didapatkan 5 profil protein dengan berat molekul yaitu: 42.3 kDa.9 kDa. . 28. Elektroforesis dengan Acrylamid (PAGE) merupakan metode standar untuk memisahkan.4 kDa dan 13. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 1.9 kDa. sampel yang digunakan relatif sedikit dan lokasi DNA dapat langsung diamati dengan menggunakan perak nitrat sebagai zat warna. 1991).

Biasanya semakin besar berat molekulnya. Pemilihan konsentrasi gel yang tepat juga menentukan keberhasilan pemisahan fraksi protein karena menentukan besar poripori matriks gel. yang dapat digunakan sebagai dasar pengembangan reagen diagnostik dan terapi masih perlu penelitian lebih lanjut. 39.4 kDa dan 13. 28. 24 kDa. Kodyman (2000) menyatakan bahwa antigen yang mengandung protein dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa merupakan antigen yang sangat imunogenik. makin tinggi konsentrasi gel maka pori yang terbentuk semakin kecil.2 kDa. 7 kDa. didapatkan 13 profil protein.4 kDa. 4 kDa. contortus.4 kDa.6 kDa.3 kDa.9 kDa dan 24. profil protein dengan berat molekul 28. 4 kDa. semakin imunogenik tetapi tidak menutup kemungkinan protein dengan berat molekul kecil dapat bertindak sebagai imunogen. contortus. Pemberian asam asetat diperlukan untuk menghentikan reaksi agar pewarnaan tidak terlalu gelap sehingga dapat terbaca. Profil protein yang dominan adalah 19. buffer bertujuan untuk menghantarkan listrik agar cairan sampel dapat turun ke dasar plate. 14. Pemberian Temed dan APS harus disesuaikan dengan kebutuhan karena apabila terlalu banyak dapat menyebabkan protein teroksidasi dan perubahan pada buffer. 3. yaitu: 42.4 kDa adalah profil yang tercat tebal. KESIMPULAN Berdasarkan hasil identifikasi protein ekskresi-sekresi Haemonchus contortus dengan SDS-PAGE didapatkan lima profil protein yaitu: 42. 14.3 kDa. contortus dewasa.9 kDa.9 kDa. Dari lima profil protein tersebut. 9 kDa. Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Lastuti dkk (2001) terhadap intestin H.4 kDa kemungkinan besar adalah protein yang sangat imunogenik sehingga dapat digunakan sebagai bahan diagnosa dan terapi haemonchosis.9 kDa.6 kDa. 11. 1987).4 kDa.9 kDa dan 24. Dari kelima profil protein tersebut.6 kDa.9 kDa. 27. 24.8 kDa dan 3. 19. didapatkan dua profil yang tercat tebal yaitu protein dengan berat molekul 28. Hasil elektroforesis dengan metode SDS-PAGE didapatkan beberapa profil protein ekskresi-sekresi H. .8 kDa dan 3. yaitu: 46 kDa. Pencucian dengan E. walaupun molekul besar jauh lebih baik (Tizard. sedangkan pemakaian APS yang terlalu sedikit dapat memperlambat reaksi sehingga polimerasi akan berjalan lambat. Dari beberapa profil protein ekskresi-sekresi yang didapatkan dalam penelitian ini.9 kDa.6 kDa. 3.9 kDa. sehingga dalam penelitian ini protein yang memiliki berat molekul 13. 28. 24.4 kDa dan 13. 41.3 kDa.Zat lain yang digunakan adalah Temed sebagai inisiator terjadinya polimerisasi dan amonium persulfat (APS) sebagai katalisator. Dari hasil penelitian tersebut dapat dikatakan bahwa kemungkinan profil protein 24 kDa berasal dari intestin H. 11.9 kDa dan 24. 36 kDa. dimana tebal tipisnya pita protein yang tercat merupakan gambaran banyaknya protein yang terkandung dalam profil protein ekskresi-sekresi. 39. Pemakaian Laemmli buffer dalam penelitian ini bertujuan agar fraksi protein saat dirunning dapat terpisah dengan sempurna.4 kDa.3 kDa. 9 kDa.

selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.. drh. Fedik Abdul antam.. Nunuk Dyah Retno L. selaku koordinator Bagian Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. M. Dr.UCAPAN TERIMA KASIH Prof.S. M. Ismudiono...S. drh. selaku pembimbing kedua. selaku pembimbing pertama dan Tri Nurhajati. drh. .S. drh. Dr. M.

Ascaris vitulorum and Toxocara canis. Maklad. Egyp. Levine. H. Axelsen. 214. Toxocara vitulorum and Moniezia expansa. Immunochemical Methods in Cell and Mollecular Biology. Protection in Lambs Vaccinated with H. M. W. Prosiding Seminar Parasitologi Nasional IV. E. Profil Protein Intestine H. PAU – Bioteknologi Universitas Gajah Mada. J. Parasitologi Veteriner. S. 1999. Surabaya. Meyer. 1983. contortus Dewasa. 1992. . Yogyakarta. Safar. D. F. J and J. Egyp. Blackwell Scientific Publications. contortus Antigens is Age Related and Corellates with IgE Rather than IgG1 Antibody. Universitas Airlangga. I.. Aksono. Peran Serta Masyarakat Dalam Upaya Pengendalian Penyakit Parasitik Pada Hewan.. 2000. R. 39-44. Mufasirin dan B. McKellar and J. Rekayasa Genetika. E. A. 417-424.. 1-95. 2001. El-Massry. H. Mollecular Identity of Major Cross Reactive Adult Antigens in Fasciola gigantica. 1998. Diterjemahkan oleh Gatot Ashadi. 254-257. 30 (2): 561-571. H. Saunders Company. Parasite. O. T. Koswara. Soc. Huntley. 22 (1): 171-176. J. 1987. D. 22 (1): 13-20. Tizard. Lastuti. N. Abstrak. Parasitol. Jakarta.DAFTAR PUSTAKA Abdel-Rahman. Parasitol. 29 (2): 335-345 Kodyman. Gajah Mada University Press. Parasitol. B. N. F. J. Protein Chromatographyc Study on Adult Ascaris lumbricoides. H. 2000. H. Handbook of Immunoprecipitation in Gel Techniques. Soc. 1991. Lemlit. Harcourtbrace Jovanich Publisher. M. Yogyakarta. A. 1987. Jan. Characterization of Antigenic Property of Toxocara canis and Toxocara leonine Adults and Larvae Through Immunodiagnostic Electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot Technique.. Egyp. Immunol. Academic Press Inc. Artama. Vanleuwen. Perkumpulan Pemberantasan Penyakit Parasit Indonesia. Abdel-Megeed. 1990.. N. Wayan. R. R. Australia. An Introduction of Veterinary Immunology. A. Scalling. and K. Soc. N. El-Rifaei and K. Walker.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful