P. 1
8. Eksresi-Sekresi Cacing.docx

8. Eksresi-Sekresi Cacing.docx

|Views: 21|Likes:
Dipublikasikan oleh Dedy Setiady D'black Hawk

More info:

Published by: Dedy Setiady D'black Hawk on Apr 06, 2013
Hak Cipta:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOCX, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

02/04/2014

pdf

text

original

IDENTIFICATION OF EXCRETION – SECRETION PROTEIN PROFILE OF THE ADULT Haemonchus contortus WITH SDS-PAGE Artha Rini Pasila

Mahasiswa, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya ABSTRACT The aim of this research is to identify excretion – secretion protein (ESP) profile of Haemonchus contortus which presented in mollecular weight. One hundred female Haemonchus contortus were isolated from sheeps and goats’ abomasum from Surabaya Slaughter House, worms were washed by Phosphat Buffer Saline (PBS) then incubated in PBS with pH 7,0 and temperature 37°C for a night. Excretion – secretion liquid that worms produced in PBS isolated with saturated ammonium, then SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamid Gel Electrophorese) method used to identified excretion – secretion protein profile. Result of this research got 5 excretion – secretion protein profile : 42,3 kilo Dalton (kDa); 39,3 kDa; 28,9 kDa; 24,4 kDa and 13,9 kDa. Key words : Haemonchus contortus, ESP, SDS-PAGE

1990). Semakin besar molekul protein eskresi-sekresi. khususnya gangguan endoparasit. daging. 1987).. sehingga harus ditetaskan dan larva dibiarkan berkembang sampai larva stadium ke-3 yang infektif kemudian diidentifikasi (Levine. seperti penggunaan antigen dari hasil ekskresisekresi H. penelitian ini bertujuan mengetahui profil protein dari cacing Haemonchus . 1990). contortus memiliki berat molekul tertentu. Banyak penelitian yang mengarah ke pembuatan vaksin molekuler untuk mengantisipasi problem yang ditimbulkan oleh cacing dengan menggunakan antigen dari produk cacing. 2000). 1992. mencegah pencemaran pakan dan minuman dari tinja dan menyediakan tempat yang telah didesinfeksi atau padang rumput yang tidak terinfeksi H. cepat berkembang biak serta dapat menghasilkan pupuk. melakukan penghitungan telur H. seperti antigen somatik (El-Massry.p. semakin besar kemungkinan protein tersebut imunogenik (Tizard. Parasit dianggap sebagai penghambat dalam pembangunan peternakan. Ostertagia sp dan Trichostrongylus sp mirip sekali satu sama lain. Pemberian antelmintik untuk mengendalikan infeksi cacing harus memperhatikan efektivitas dan spektrum. contortus per gram tinja induk semang sampai batas patogen yaitu 300 butir telur per gram tinja (t. murah serta efek samping minimal. harga relatif murah. antigen dari ekstrak cacing dewasa (Safar et al.PENDAHULUAN Ruminansia kecil khususnya domba sangat potensial untuk dikembangkan karena selain sebagai sumber protein hewani yang baik. wol dan kulit sebagai komoditi ekspor yang cukup berharga. contortus dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa yang merupakan protein yang sangat imunogenik (Kodyman et al. Pengembangan ternak domba dilaksanakan dengan meningkatkan populasi dan produktivitas domba diimbangi sistem pemeliharaan yang baik serta pengendalian dan pemberantasan penyakit. terutama yang berhubungan dengan peningkatan populasi dan produksi ternak (Koswara. kualitas kulit. Haemonchosis dapat didiagnosis dengan menemukan cacing pada saat bedah bangkai atau menemukan telur cacing pada saat pemeriksaan tinja. tetapi hal ini sulit dilakukan karena telur Haemonchus sp. penurunan produksi susu. Berdasarkan masalah di atas. kemudahan cara pemakaian. menimbulkan kerugian ekonomi yaitu penurunan berat badan. Pengendalian dapat juga ditempuh dengan memberikan pengobatan menggunakan antelmintik yang tepat. 2000). 2001) dan ekskresi-sekresi untuk pengembangan vaksin. 1999). Profil protein ekskresi-sekresi H. 1998). Pengendalian haemonchosis dapat dilakukan dengan menekan jumlah arva infektif melalui pengeringan lapangan tempat domba merumput. contortus untuk melahirkan (Levine. contortus dewasa (Lastuti dkk. protein dari intestin H.g) serta melakukan pencegahan yaitu menyapih anak domba seawal mungkin karena domba dewasa merupakan sumber infeksi bagi domba muda. Disebabkan oleh cacing Haemonchus contortus. Haemonchosis merupakan penyakit parasiter yang paling sering menyerang domba. wol dan terhambatnya pertumbuhan domba muda baik secara kualitatif maupun kuantitatif serta kematian domba. Abdel-Rahman and Megeed.

cacing dibedakan dengan melihat adanya intestin dan uterus yang berselangseling. setelah mengeras pada bagian atasnya dimasukkan stacking gel yang telah dipersiapkan. kemudian diberikan larutan pengembang warna. Penghitungan berat molekul dilakukan dengan membandingkan standart marker. yaitu cairan yang dikeluarkan cacing sebagai sisa metabolisme dalam PBS diambil untuk isolasi protein ekskresisekresi. kemudian dicuci dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali. Setelah dicuci gel diwarnai dengan AgNO3 selama 15 menit sambil digoyang. Elektroforesis Protein Ekskresi Sekresi dengan SDS-PAGE Bahan disiapkan kemudian dibuat running gel dan dimasukkan ke dalam plat kaca. Setelah running. 40 mA pada chamber yang telah diisi Electrode Buffer 1x. contortus betina dewasa dalam keadaan hidup diisolasi dari abomasum domba dan kambing yang dipotong di RPH Surabaya. dengan suhu 4°C. METODE PENELITIAN Isolasi dan Kultivasi H. 1983 yang sudah dimodifikasi. kemudian dilakukan sentrifugasi 10. contortus dewasa. 1987 yang sudah dimodifikasi). Cairan ekskresi maupun sekresi. Meyer and Walker. Pelet yang didapatkan kemudian diresuspensi dengan PBS dan siap untuk identifikasi protein. Setelah perebusan. contortus invitro Seratus ekor cacing H. Sebanyak 10 μl sampel protein ditambah laemmli buffer dengan perbandingan 2:1 kemudian dilakukan perebusan pada 100°C selama lima menit. Hasil gel yang telah tampak disimpan dalam larutan gliserol 10% (Axelsen. dimasukkan ke dalam lubang pada stacking gel yang tersedia dan dilakukan running dengan 100 volt.contortus dewasa berdasarkan berat molekul protein ekskresi-sekresi cacing H. Setelah pita protein terlihat maka dapat dihentikan dengan penambahan asam asetat 10%. Cacing diinkubasi dalam PBS pada cawan petri dengan temperatur 37°C dan pH 7.000 rpm selama 10 menit.0 selama semalam. kemudian dilakukan pencucian dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) sampai bersih. Isolasi Protein Ekskresi-Sekresi Protein ekskresi-sekresi yang terdapat dalam PBS hasil kultivasi cacing diisolasi dengan penambahan amonium jenuh kemudian dicampur sampai rata dan diinkubasi pada suhu 4°C selama semalam. . kemudian dilakukan pencucian dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali selama dua menit. gel dimasukkan ke larutan pencuci yang terdiri dari empat tahap pencucian.

28.5 ml Tris HCl pH 8. Komposisi Phosphat Buffer Saline (PBS) NaCl 13.8 1.5 kDa Rf = 7. 13.7 /12 = 0. contortus dengan Menggunakan SDS-PAGE 12 % Rf = Jarak band dari sumuran / Panjang gel sesudah di running ∗ Marker : Panjang gel sesudah di running = 12 1.4 kDa 5. Komposisi Stacking Gel 12 % Acrilamid 0. Protein 30 kDa Rf = 3. Rf = 5.25/12 = 0. Komposisi Running Gel 12 % Acrilamid 2.1/12 = 0.74.3 kDa 2.80 ml .9 kDa Komposisi Bahan-Bahan Yang Digunakan Dalam Penelitian 1.80 ml SDS 0.25/12 = 0.10 2.679 X Hasil : 1.1 kDa Rf = 4.2 ml Aquades 1.34 5.5 % 1.7/12 = 0.12 3. 39.48 Dari data marker.1 ml Temed 5.2/12 = 0.679 X Y = 49.8 0.2 g) Na2HPO4 x 2H2O 8 mM (1. 42.5 % 0.14 3.48 ∗ Sumuran I : 1.2 ml SDS 0.7 mM (8 g) KCl 2.66 ml Tris HCl pH 6.766 + (–) 74.34 5.10 2. dibuat persamaan linier dimana koefisien X = Rf marker dan Y = Protein marker (kDa) ⇒ didapatkan persamaan : Y = 49. Protein 14.7 mM (0.766 .28 4. Protein 6.2 /12 = 0.42 g) Aquades ad 1000 ml 2.80 ml Aquades 0. 24.85/12 = 0.9 kDa 4. Protein 20. Rf = 3.4/12 = 0.8/12 = 0.3 kDa Rf = 5. Rf = 1. Protein 45 kDa Rf = 0. Rf = 1.Perhitungan Fraksi Protein Ekskresi Sekresi H. Rf = 4.28 4.3 kDa 3.0 μl APS 10 % 30 μl 3.

Memasukkan agar ke dalam cawan petri yang telah berisi larutan pencuci 16.75 ml Aquades 93. Mematikan listrik dan melepas agar pelan-pelan 15. Membuat running gel 12 % (komposisi lengkap pada lampiran 2). Menyiapkan sampel (Laemmli Buffer + sampel) dimasukkan ke dalam eppendorf dan direbus dengan suhu 100 0C selama 5 menit 8. Tahap pencucian:  Pencucian I: Metanol 25 ml Asam asetat 3. Komposisi Pewarnaan Perak Aquades 73. Membuat stacking gel 12 % (komposisi pada lampiran 2) 6. Memasukkan sampel ke dalam lubang comb dan menghilangkan gelembung udara dengan jarum 12.7 % 50 μl Asam sitrat 5 % 100 μl Aquades 100 ml Cara Kerja SDS-PAGE 1.0 μl APS 10 % 20 μl 4. 2.75 ml Digoyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit . 3. Menambahkan butanol 5. Dituangi dengan E Buffer (kira-kira 800 ml) 11.Temed 4.25 ml Diletakkan di atas shaker dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit  Pencucian II: Metanol 25 ml Asam asetat 3. melepaskan comb dan cuci dengan E Buffer 1 kali 9. Menunggu hingga sampel turun seluruhnya 14.5 ml NaOH 0. Memasukkan stacking gel ke atas cetakan running gel hingga penuh kemudian memasukkan comb ke atas stacking gel dan diinkubasi selama 25 menit 7. Semua bahan yang diperlukan disiapkan.75 ml Aquades 71. Komposisi Electrophoresis Buffer Tris (hidroksimetil) aminomethan 30. Komposisi Pengembang Warna Formaldehid 3.29 g Glisin 144. Memasukkan cetakan ke Bio Rad 10.4 ml AgNo3 dilarutkan dalam 4 ml Aquades 6.36 % 21 ml NH3 1.13 g SDS CH12H2SO4 10 g Aquades ad 1000 ml 5. Memasukkan running gel lewat dinding kaca hingga mencapai 1 cm dari atas 4. Memasang listrik dengan tegangan 125 V dan 40 mA (proses running) 13. Setelah inkubasi selesai.

9 kDa. identifikasi. Memasukkan pengembang warna (komposisi pada lampiran 2) dan goyangkan selama 5 menit 20. dalam hal ini digunakan polyacrylamide. Teknik ini biasa digunakan karena murah. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 22. 28.9 kDa. 24. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 19. . karakterisasi dan purifikasi molekul DNA/RNA (Artama.Pencucian III: Glutaraldehid 10 ml Aquades 90 ml  Pencucian IV: aquades @ 100 ml 3 kali selama 30 menit 17. Elektroforesis dengan Acrylamid (PAGE) merupakan metode standar untuk memisahkan. sampel yang digunakan relatif sedikit dan lokasi DNA dapat langsung diamati dengan menggunakan perak nitrat sebagai zat warna. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 1.4 kDa dan 13. Prinsip dasar SDSPAGE ini adalah denaturasi protein oleh sodium dodecyl sulphate yang dilanjutkan dengan pemisahan molekul berdasarkan berat molekulnya dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel. Menghentikan reaksi dengan menambahkan asam asetat 10 % 21. Pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE bertujuan untuk memisahkan protein dalam sampel berdasarkan berat molekul. sederhana.3 kDa. 39. 1991).3 kDa. Menambahkan gliserol 10 % (Gliserol 10 ml + aquades 90 ml)  HASIL DAN PEMBAHASAN Berdasarkan hasil penelitian dengan elektroforesis dari ekskresi-sekresi cacing Haemonchus contortus dengan metode SDS-PAGE didapatkan 5 profil protein dengan berat molekul yaitu: 42. Tahap Pewarnaan Memasukkan komposisi pewarnaan perak (lampiran 2) dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 15 menit 18.

6 kDa.9 kDa.9 kDa dan 24.4 kDa. contortus. contortus dewasa. 9 kDa. sedangkan pemakaian APS yang terlalu sedikit dapat memperlambat reaksi sehingga polimerasi akan berjalan lambat. 24. 28. 11. buffer bertujuan untuk menghantarkan listrik agar cairan sampel dapat turun ke dasar plate.9 kDa. 3. profil protein dengan berat molekul 28. 14. didapatkan dua profil yang tercat tebal yaitu protein dengan berat molekul 28. yaitu: 46 kDa. 24. 3.9 kDa. Pemilihan konsentrasi gel yang tepat juga menentukan keberhasilan pemisahan fraksi protein karena menentukan besar poripori matriks gel. yang dapat digunakan sebagai dasar pengembangan reagen diagnostik dan terapi masih perlu penelitian lebih lanjut. Dari lima profil protein tersebut.9 kDa. sehingga dalam penelitian ini protein yang memiliki berat molekul 13. . dimana tebal tipisnya pita protein yang tercat merupakan gambaran banyaknya protein yang terkandung dalam profil protein ekskresi-sekresi. 1987). 9 kDa.4 kDa adalah profil yang tercat tebal.6 kDa. 4 kDa.8 kDa dan 3. contortus.6 kDa. Pencucian dengan E. 11. Hasil elektroforesis dengan metode SDS-PAGE didapatkan beberapa profil protein ekskresi-sekresi H.8 kDa dan 3. walaupun molekul besar jauh lebih baik (Tizard. Profil protein yang dominan adalah 19. Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Lastuti dkk (2001) terhadap intestin H. KESIMPULAN Berdasarkan hasil identifikasi protein ekskresi-sekresi Haemonchus contortus dengan SDS-PAGE didapatkan lima profil protein yaitu: 42. 27.4 kDa.4 kDa.9 kDa.Zat lain yang digunakan adalah Temed sebagai inisiator terjadinya polimerisasi dan amonium persulfat (APS) sebagai katalisator. 19.4 kDa. Dari kelima profil protein tersebut.3 kDa. 41.4 kDa kemungkinan besar adalah protein yang sangat imunogenik sehingga dapat digunakan sebagai bahan diagnosa dan terapi haemonchosis.4 kDa dan 13. 4 kDa. 39. semakin imunogenik tetapi tidak menutup kemungkinan protein dengan berat molekul kecil dapat bertindak sebagai imunogen.9 kDa dan 24. yaitu: 42. Dari beberapa profil protein ekskresi-sekresi yang didapatkan dalam penelitian ini.9 kDa dan 24. 14.2 kDa.4 kDa dan 13.3 kDa. Dari hasil penelitian tersebut dapat dikatakan bahwa kemungkinan profil protein 24 kDa berasal dari intestin H. 7 kDa. makin tinggi konsentrasi gel maka pori yang terbentuk semakin kecil.3 kDa.3 kDa. Pemberian Temed dan APS harus disesuaikan dengan kebutuhan karena apabila terlalu banyak dapat menyebabkan protein teroksidasi dan perubahan pada buffer. 28. 39. 24 kDa. Biasanya semakin besar berat molekulnya. Pemberian asam asetat diperlukan untuk menghentikan reaksi agar pewarnaan tidak terlalu gelap sehingga dapat terbaca.6 kDa. 36 kDa. Kodyman (2000) menyatakan bahwa antigen yang mengandung protein dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa merupakan antigen yang sangat imunogenik.9 kDa. Pemakaian Laemmli buffer dalam penelitian ini bertujuan agar fraksi protein saat dirunning dapat terpisah dengan sempurna. didapatkan 13 profil protein.

S. drh. Fedik Abdul antam.UCAPAN TERIMA KASIH Prof. selaku pembimbing kedua.S.S. Ismudiono. selaku pembimbing pertama dan Tri Nurhajati. selaku koordinator Bagian Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.. drh. M.. Dr. selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.. Dr. drh. Nunuk Dyah Retno L. . M.. drh. M.

Perkumpulan Pemberantasan Penyakit Parasit Indonesia. McKellar and J. 417-424. and K. Peran Serta Masyarakat Dalam Upaya Pengendalian Penyakit Parasitik Pada Hewan. contortus Dewasa. B. 1990. Australia. Parasitol. R. D. Egyp. Maklad. H. 1991. Meyer. Abstrak. El-Massry. R. Rekayasa Genetika. H. 1992. W. Protein Chromatographyc Study on Adult Ascaris lumbricoides. Aksono.. Prosiding Seminar Parasitologi Nasional IV. S. O. Wayan. Soc. 214. Jan. Profil Protein Intestine H. Toxocara vitulorum and Moniezia expansa. Harcourtbrace Jovanich Publisher. 22 (1): 171-176. H. contortus Antigens is Age Related and Corellates with IgE Rather than IgG1 Antibody. Artama. Yogyakarta. 1987. Protection in Lambs Vaccinated with H. Walker. H. N. Soc. E. J. M.DAFTAR PUSTAKA Abdel-Rahman. Axelsen. Blackwell Scientific Publications. Jakarta. Surabaya. 22 (1): 13-20. Levine. Parasitologi Veteriner. Academic Press Inc. Immunochemical Methods in Cell and Mollecular Biology. Safar. R. A. E. A. N. Parasite. T. I. 254-257. El-Rifaei and K. F.. J. 1999. An Introduction of Veterinary Immunology. 1-95. 2001. M. Mollecular Identity of Major Cross Reactive Adult Antigens in Fasciola gigantica. Abdel-Megeed. Characterization of Antigenic Property of Toxocara canis and Toxocara leonine Adults and Larvae Through Immunodiagnostic Electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot Technique. A. 2000. 1998. Parasitol. 1983.. Yogyakarta. N. 29 (2): 335-345 Kodyman. Koswara. Handbook of Immunoprecipitation in Gel Techniques. Vanleuwen. PAU – Bioteknologi Universitas Gajah Mada. Parasitol. Immunol. Gajah Mada University Press. D.. J. . F. Scalling. 1987. Egyp. Soc. Tizard. Universitas Airlangga. Egyp. 30 (2): 561-571. 39-44. Lemlit. N. Lastuti. Saunders Company. Huntley. Mufasirin dan B. J and J. 2000. Diterjemahkan oleh Gatot Ashadi. H. Ascaris vitulorum and Toxocara canis..

You're Reading a Free Preview

Mengunduh
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->