IDENTIFICATION OF EXCRETION – SECRETION PROTEIN PROFILE OF THE ADULT Haemonchus contortus WITH SDS-PAGE Artha Rini Pasila

Mahasiswa, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya ABSTRACT The aim of this research is to identify excretion – secretion protein (ESP) profile of Haemonchus contortus which presented in mollecular weight. One hundred female Haemonchus contortus were isolated from sheeps and goats’ abomasum from Surabaya Slaughter House, worms were washed by Phosphat Buffer Saline (PBS) then incubated in PBS with pH 7,0 and temperature 37°C for a night. Excretion – secretion liquid that worms produced in PBS isolated with saturated ammonium, then SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamid Gel Electrophorese) method used to identified excretion – secretion protein profile. Result of this research got 5 excretion – secretion protein profile : 42,3 kilo Dalton (kDa); 39,3 kDa; 28,9 kDa; 24,4 kDa and 13,9 kDa. Key words : Haemonchus contortus, ESP, SDS-PAGE

seperti antigen somatik (El-Massry. Semakin besar molekul protein eskresi-sekresi. 1987). Pengendalian dapat juga ditempuh dengan memberikan pengobatan menggunakan antelmintik yang tepat. terutama yang berhubungan dengan peningkatan populasi dan produksi ternak (Koswara. 2001) dan ekskresi-sekresi untuk pengembangan vaksin. contortus untuk melahirkan (Levine. 2000). 1999). protein dari intestin H. wol dan kulit sebagai komoditi ekspor yang cukup berharga. penelitian ini bertujuan mengetahui profil protein dari cacing Haemonchus . kualitas kulit. harga relatif murah. sehingga harus ditetaskan dan larva dibiarkan berkembang sampai larva stadium ke-3 yang infektif kemudian diidentifikasi (Levine. seperti penggunaan antigen dari hasil ekskresisekresi H. contortus dewasa (Lastuti dkk. Parasit dianggap sebagai penghambat dalam pembangunan peternakan. Berdasarkan masalah di atas. 1992. semakin besar kemungkinan protein tersebut imunogenik (Tizard. 2000). daging. menimbulkan kerugian ekonomi yaitu penurunan berat badan. contortus per gram tinja induk semang sampai batas patogen yaitu 300 butir telur per gram tinja (t.. Pengendalian haemonchosis dapat dilakukan dengan menekan jumlah arva infektif melalui pengeringan lapangan tempat domba merumput. murah serta efek samping minimal. 1998). mencegah pencemaran pakan dan minuman dari tinja dan menyediakan tempat yang telah didesinfeksi atau padang rumput yang tidak terinfeksi H. Banyak penelitian yang mengarah ke pembuatan vaksin molekuler untuk mengantisipasi problem yang ditimbulkan oleh cacing dengan menggunakan antigen dari produk cacing. 1990). antigen dari ekstrak cacing dewasa (Safar et al. Profil protein ekskresi-sekresi H. Haemonchosis dapat didiagnosis dengan menemukan cacing pada saat bedah bangkai atau menemukan telur cacing pada saat pemeriksaan tinja. contortus dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa yang merupakan protein yang sangat imunogenik (Kodyman et al. cepat berkembang biak serta dapat menghasilkan pupuk. Haemonchosis merupakan penyakit parasiter yang paling sering menyerang domba. tetapi hal ini sulit dilakukan karena telur Haemonchus sp.PENDAHULUAN Ruminansia kecil khususnya domba sangat potensial untuk dikembangkan karena selain sebagai sumber protein hewani yang baik. Disebabkan oleh cacing Haemonchus contortus. kemudahan cara pemakaian. Pemberian antelmintik untuk mengendalikan infeksi cacing harus memperhatikan efektivitas dan spektrum. wol dan terhambatnya pertumbuhan domba muda baik secara kualitatif maupun kuantitatif serta kematian domba. contortus memiliki berat molekul tertentu. melakukan penghitungan telur H. Pengembangan ternak domba dilaksanakan dengan meningkatkan populasi dan produktivitas domba diimbangi sistem pemeliharaan yang baik serta pengendalian dan pemberantasan penyakit. Abdel-Rahman and Megeed. Ostertagia sp dan Trichostrongylus sp mirip sekali satu sama lain. 1990). penurunan produksi susu.g) serta melakukan pencegahan yaitu menyapih anak domba seawal mungkin karena domba dewasa merupakan sumber infeksi bagi domba muda. khususnya gangguan endoparasit.p.

cacing dibedakan dengan melihat adanya intestin dan uterus yang berselangseling. Setelah pita protein terlihat maka dapat dihentikan dengan penambahan asam asetat 10%. METODE PENELITIAN Isolasi dan Kultivasi H. gel dimasukkan ke larutan pencuci yang terdiri dari empat tahap pencucian. Meyer and Walker. Penghitungan berat molekul dilakukan dengan membandingkan standart marker. dengan suhu 4°C. kemudian diberikan larutan pengembang warna. contortus betina dewasa dalam keadaan hidup diisolasi dari abomasum domba dan kambing yang dipotong di RPH Surabaya. Elektroforesis Protein Ekskresi Sekresi dengan SDS-PAGE Bahan disiapkan kemudian dibuat running gel dan dimasukkan ke dalam plat kaca. contortus invitro Seratus ekor cacing H. kemudian dilakukan pencucian dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) sampai bersih. contortus dewasa. yaitu cairan yang dikeluarkan cacing sebagai sisa metabolisme dalam PBS diambil untuk isolasi protein ekskresisekresi. Sebanyak 10 μl sampel protein ditambah laemmli buffer dengan perbandingan 2:1 kemudian dilakukan perebusan pada 100°C selama lima menit.0 selama semalam. Setelah perebusan. Cairan ekskresi maupun sekresi. Cacing diinkubasi dalam PBS pada cawan petri dengan temperatur 37°C dan pH 7. setelah mengeras pada bagian atasnya dimasukkan stacking gel yang telah dipersiapkan. Pelet yang didapatkan kemudian diresuspensi dengan PBS dan siap untuk identifikasi protein. Hasil gel yang telah tampak disimpan dalam larutan gliserol 10% (Axelsen. Setelah running. kemudian dilakukan sentrifugasi 10. 1987 yang sudah dimodifikasi). Isolasi Protein Ekskresi-Sekresi Protein ekskresi-sekresi yang terdapat dalam PBS hasil kultivasi cacing diisolasi dengan penambahan amonium jenuh kemudian dicampur sampai rata dan diinkubasi pada suhu 4°C selama semalam. dimasukkan ke dalam lubang pada stacking gel yang tersedia dan dilakukan running dengan 100 volt.contortus dewasa berdasarkan berat molekul protein ekskresi-sekresi cacing H. kemudian dicuci dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali. 40 mA pada chamber yang telah diisi Electrode Buffer 1x. . 1983 yang sudah dimodifikasi.000 rpm selama 10 menit. kemudian dilakukan pencucian dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali selama dua menit. Setelah dicuci gel diwarnai dengan AgNO3 selama 15 menit sambil digoyang.

8 0. Protein 6.1 kDa Rf = 4. Komposisi Running Gel 12 % Acrilamid 2.10 2. 28.80 ml . 39. Protein 45 kDa Rf = 0.48 Dari data marker. 42.2 /12 = 0.679 X Y = 49.7 /12 = 0.1 ml Temed 5. Protein 14.2 ml Aquades 1.2 g) Na2HPO4 x 2H2O 8 mM (1.42 g) Aquades ad 1000 ml 2. Rf = 3.5 % 0.766 . Protein 30 kDa Rf = 3.4 kDa 5.12 3.66 ml Tris HCl pH 6. Komposisi Stacking Gel 12 % Acrilamid 0.14 3. Rf = 5. contortus dengan Menggunakan SDS-PAGE 12 % Rf = Jarak band dari sumuran / Panjang gel sesudah di running ∗ Marker : Panjang gel sesudah di running = 12 1.28 4. Rf = 1.679 X Hasil : 1. Rf = 4.3 kDa Rf = 5.5 % 1.74.2/12 = 0. Komposisi Phosphat Buffer Saline (PBS) NaCl 13.Perhitungan Fraksi Protein Ekskresi Sekresi H.7/12 = 0.80 ml SDS 0.80 ml Aquades 0.9 kDa 4.8/12 = 0.766 + (–) 74.34 5. Rf = 1.85/12 = 0.25/12 = 0.3 kDa 2.0 μl APS 10 % 30 μl 3.25/12 = 0. Protein 20.7 mM (8 g) KCl 2.48 ∗ Sumuran I : 1.1/12 = 0.9 kDa Komposisi Bahan-Bahan Yang Digunakan Dalam Penelitian 1.8 1. dibuat persamaan linier dimana koefisien X = Rf marker dan Y = Protein marker (kDa) ⇒ didapatkan persamaan : Y = 49.5 ml Tris HCl pH 8.3 kDa 3.2 ml SDS 0. 13.34 5.5 kDa Rf = 7.4/12 = 0.28 4.10 2.7 mM (0. 24.

Komposisi Electrophoresis Buffer Tris (hidroksimetil) aminomethan 30. Menambahkan butanol 5. Menyiapkan sampel (Laemmli Buffer + sampel) dimasukkan ke dalam eppendorf dan direbus dengan suhu 100 0C selama 5 menit 8. Memasukkan cetakan ke Bio Rad 10. Membuat stacking gel 12 % (komposisi pada lampiran 2) 6. 2.5 ml NaOH 0.Temed 4. Memasukkan agar ke dalam cawan petri yang telah berisi larutan pencuci 16. Komposisi Pewarnaan Perak Aquades 73. Setelah inkubasi selesai.13 g SDS CH12H2SO4 10 g Aquades ad 1000 ml 5. Semua bahan yang diperlukan disiapkan.75 ml Aquades 93. Memasukkan running gel lewat dinding kaca hingga mencapai 1 cm dari atas 4. Memasang listrik dengan tegangan 125 V dan 40 mA (proses running) 13.25 ml Diletakkan di atas shaker dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit  Pencucian II: Metanol 25 ml Asam asetat 3. Membuat running gel 12 % (komposisi lengkap pada lampiran 2). Mematikan listrik dan melepas agar pelan-pelan 15.75 ml Aquades 71. Dituangi dengan E Buffer (kira-kira 800 ml) 11. Komposisi Pengembang Warna Formaldehid 3. melepaskan comb dan cuci dengan E Buffer 1 kali 9.4 ml AgNo3 dilarutkan dalam 4 ml Aquades 6. Memasukkan sampel ke dalam lubang comb dan menghilangkan gelembung udara dengan jarum 12.0 μl APS 10 % 20 μl 4.36 % 21 ml NH3 1. Menunggu hingga sampel turun seluruhnya 14. Tahap pencucian:  Pencucian I: Metanol 25 ml Asam asetat 3.29 g Glisin 144. Memasukkan stacking gel ke atas cetakan running gel hingga penuh kemudian memasukkan comb ke atas stacking gel dan diinkubasi selama 25 menit 7.75 ml Digoyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit . 3.7 % 50 μl Asam sitrat 5 % 100 μl Aquades 100 ml Cara Kerja SDS-PAGE 1.

9 kDa. 28. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 19. 39. 1991). identifikasi.3 kDa. Menghentikan reaksi dengan menambahkan asam asetat 10 % 21.Pencucian III: Glutaraldehid 10 ml Aquades 90 ml  Pencucian IV: aquades @ 100 ml 3 kali selama 30 menit 17. Tahap Pewarnaan Memasukkan komposisi pewarnaan perak (lampiran 2) dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 15 menit 18. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 1. Memasukkan pengembang warna (komposisi pada lampiran 2) dan goyangkan selama 5 menit 20.3 kDa. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 22. karakterisasi dan purifikasi molekul DNA/RNA (Artama. dalam hal ini digunakan polyacrylamide. 24. Elektroforesis dengan Acrylamid (PAGE) merupakan metode standar untuk memisahkan. Menambahkan gliserol 10 % (Gliserol 10 ml + aquades 90 ml)  HASIL DAN PEMBAHASAN Berdasarkan hasil penelitian dengan elektroforesis dari ekskresi-sekresi cacing Haemonchus contortus dengan metode SDS-PAGE didapatkan 5 profil protein dengan berat molekul yaitu: 42. Prinsip dasar SDSPAGE ini adalah denaturasi protein oleh sodium dodecyl sulphate yang dilanjutkan dengan pemisahan molekul berdasarkan berat molekulnya dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel. sampel yang digunakan relatif sedikit dan lokasi DNA dapat langsung diamati dengan menggunakan perak nitrat sebagai zat warna. Teknik ini biasa digunakan karena murah.4 kDa dan 13. sederhana. .9 kDa. Pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE bertujuan untuk memisahkan protein dalam sampel berdasarkan berat molekul.

4 kDa. Biasanya semakin besar berat molekulnya.4 kDa.2 kDa. 27. buffer bertujuan untuk menghantarkan listrik agar cairan sampel dapat turun ke dasar plate. Dari lima profil protein tersebut.4 kDa dan 13. 7 kDa.3 kDa. Hasil elektroforesis dengan metode SDS-PAGE didapatkan beberapa profil protein ekskresi-sekresi H. Pemakaian Laemmli buffer dalam penelitian ini bertujuan agar fraksi protein saat dirunning dapat terpisah dengan sempurna. Profil protein yang dominan adalah 19. yaitu: 46 kDa. walaupun molekul besar jauh lebih baik (Tizard. sedangkan pemakaian APS yang terlalu sedikit dapat memperlambat reaksi sehingga polimerasi akan berjalan lambat. 39.4 kDa. 11.6 kDa. sehingga dalam penelitian ini protein yang memiliki berat molekul 13.9 kDa. 36 kDa. Dari beberapa profil protein ekskresi-sekresi yang didapatkan dalam penelitian ini.8 kDa dan 3. Pemberian asam asetat diperlukan untuk menghentikan reaksi agar pewarnaan tidak terlalu gelap sehingga dapat terbaca. profil protein dengan berat molekul 28. contortus. . contortus dewasa. 3. contortus.9 kDa. 19. 1987). KESIMPULAN Berdasarkan hasil identifikasi protein ekskresi-sekresi Haemonchus contortus dengan SDS-PAGE didapatkan lima profil protein yaitu: 42. Pencucian dengan E. 3. yang dapat digunakan sebagai dasar pengembangan reagen diagnostik dan terapi masih perlu penelitian lebih lanjut.4 kDa adalah profil yang tercat tebal. Kodyman (2000) menyatakan bahwa antigen yang mengandung protein dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa merupakan antigen yang sangat imunogenik.9 kDa dan 24. 39. 28.3 kDa.4 kDa.9 kDa dan 24.3 kDa.6 kDa. 24. 24. Dari hasil penelitian tersebut dapat dikatakan bahwa kemungkinan profil protein 24 kDa berasal dari intestin H. didapatkan dua profil yang tercat tebal yaitu protein dengan berat molekul 28. 14. 14.4 kDa dan 13. semakin imunogenik tetapi tidak menutup kemungkinan protein dengan berat molekul kecil dapat bertindak sebagai imunogen. dimana tebal tipisnya pita protein yang tercat merupakan gambaran banyaknya protein yang terkandung dalam profil protein ekskresi-sekresi.Zat lain yang digunakan adalah Temed sebagai inisiator terjadinya polimerisasi dan amonium persulfat (APS) sebagai katalisator. didapatkan 13 profil protein. 24 kDa.9 kDa.9 kDa.6 kDa.3 kDa. 11. makin tinggi konsentrasi gel maka pori yang terbentuk semakin kecil.9 kDa. Dari kelima profil protein tersebut.9 kDa. 41. 4 kDa.9 kDa dan 24.6 kDa. Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Lastuti dkk (2001) terhadap intestin H. Pemilihan konsentrasi gel yang tepat juga menentukan keberhasilan pemisahan fraksi protein karena menentukan besar poripori matriks gel. 9 kDa. Pemberian Temed dan APS harus disesuaikan dengan kebutuhan karena apabila terlalu banyak dapat menyebabkan protein teroksidasi dan perubahan pada buffer.4 kDa kemungkinan besar adalah protein yang sangat imunogenik sehingga dapat digunakan sebagai bahan diagnosa dan terapi haemonchosis. 9 kDa. yaitu: 42. 28. 4 kDa.8 kDa dan 3.

M. selaku pembimbing pertama dan Tri Nurhajati. Nunuk Dyah Retno L.. selaku koordinator Bagian Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. drh.. Fedik Abdul antam. Ismudiono. drh. Dr. M. selaku pembimbing kedua..S. M. drh..UCAPAN TERIMA KASIH Prof.S. . Dr. selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.S. drh.

Blackwell Scientific Publications. An Introduction of Veterinary Immunology. H. H.. Handbook of Immunoprecipitation in Gel Techniques. Mollecular Identity of Major Cross Reactive Adult Antigens in Fasciola gigantica. N. Egyp. J. 1990. T. Parasitol. contortus Dewasa. 214. 254-257. Protection in Lambs Vaccinated with H. Rekayasa Genetika. 1987. J. F. Jakarta. Koswara. . 30 (2): 561-571. Egyp. Soc. S. Yogyakarta. Parasite. Egyp. Maklad. and K. 2000. Characterization of Antigenic Property of Toxocara canis and Toxocara leonine Adults and Larvae Through Immunodiagnostic Electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot Technique. Protein Chromatographyc Study on Adult Ascaris lumbricoides. El-Rifaei and K. 1983. Tizard. 1987. 29 (2): 335-345 Kodyman. Australia. PAU – Bioteknologi Universitas Gajah Mada. D. Safar. R. Perkumpulan Pemberantasan Penyakit Parasit Indonesia. Levine. H. Saunders Company. B. N. McKellar and J. E. Universitas Airlangga. 1-95. D. Soc. Parasitol. Gajah Mada University Press. Toxocara vitulorum and Moniezia expansa.. Abstrak. Profil Protein Intestine H. Jan.. R. M. Academic Press Inc. Abdel-Megeed. H. Yogyakarta. Axelsen. 39-44. 1991. Prosiding Seminar Parasitologi Nasional IV. Vanleuwen. Peran Serta Masyarakat Dalam Upaya Pengendalian Penyakit Parasitik Pada Hewan. Walker. Soc. A. A. Surabaya. Harcourtbrace Jovanich Publisher. O. M. Diterjemahkan oleh Gatot Ashadi.. H. 2001. 1992. 22 (1): 171-176. Artama. 1999.DAFTAR PUSTAKA Abdel-Rahman. J and J. 2000. F. Parasitologi Veteriner. E. Parasitol. Lemlit. contortus Antigens is Age Related and Corellates with IgE Rather than IgG1 Antibody. Mufasirin dan B. N. Scalling. Wayan. A. J. Aksono. El-Massry. R. W. I. 22 (1): 13-20. Meyer. N. Huntley. Immunol. Immunochemical Methods in Cell and Mollecular Biology. 1998. 417-424. Lastuti. Ascaris vitulorum and Toxocara canis..

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful