IDENTIFICATION OF EXCRETION – SECRETION PROTEIN PROFILE OF THE ADULT Haemonchus contortus WITH SDS-PAGE Artha Rini Pasila

Mahasiswa, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya ABSTRACT The aim of this research is to identify excretion – secretion protein (ESP) profile of Haemonchus contortus which presented in mollecular weight. One hundred female Haemonchus contortus were isolated from sheeps and goats’ abomasum from Surabaya Slaughter House, worms were washed by Phosphat Buffer Saline (PBS) then incubated in PBS with pH 7,0 and temperature 37°C for a night. Excretion – secretion liquid that worms produced in PBS isolated with saturated ammonium, then SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamid Gel Electrophorese) method used to identified excretion – secretion protein profile. Result of this research got 5 excretion – secretion protein profile : 42,3 kilo Dalton (kDa); 39,3 kDa; 28,9 kDa; 24,4 kDa and 13,9 kDa. Key words : Haemonchus contortus, ESP, SDS-PAGE

1992. Pengendalian haemonchosis dapat dilakukan dengan menekan jumlah arva infektif melalui pengeringan lapangan tempat domba merumput.. penelitian ini bertujuan mengetahui profil protein dari cacing Haemonchus . terutama yang berhubungan dengan peningkatan populasi dan produksi ternak (Koswara.p. Berdasarkan masalah di atas. kualitas kulit. daging. Disebabkan oleh cacing Haemonchus contortus. contortus dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa yang merupakan protein yang sangat imunogenik (Kodyman et al. 2001) dan ekskresi-sekresi untuk pengembangan vaksin. contortus dewasa (Lastuti dkk. 1990). 2000). Haemonchosis merupakan penyakit parasiter yang paling sering menyerang domba. 1998). cepat berkembang biak serta dapat menghasilkan pupuk. Haemonchosis dapat didiagnosis dengan menemukan cacing pada saat bedah bangkai atau menemukan telur cacing pada saat pemeriksaan tinja. seperti antigen somatik (El-Massry. Abdel-Rahman and Megeed. Pengembangan ternak domba dilaksanakan dengan meningkatkan populasi dan produktivitas domba diimbangi sistem pemeliharaan yang baik serta pengendalian dan pemberantasan penyakit. Banyak penelitian yang mengarah ke pembuatan vaksin molekuler untuk mengantisipasi problem yang ditimbulkan oleh cacing dengan menggunakan antigen dari produk cacing. contortus per gram tinja induk semang sampai batas patogen yaitu 300 butir telur per gram tinja (t. melakukan penghitungan telur H. sehingga harus ditetaskan dan larva dibiarkan berkembang sampai larva stadium ke-3 yang infektif kemudian diidentifikasi (Levine. 1990). menimbulkan kerugian ekonomi yaitu penurunan berat badan. 1999). Pengendalian dapat juga ditempuh dengan memberikan pengobatan menggunakan antelmintik yang tepat. tetapi hal ini sulit dilakukan karena telur Haemonchus sp. wol dan kulit sebagai komoditi ekspor yang cukup berharga. khususnya gangguan endoparasit. contortus untuk melahirkan (Levine. contortus memiliki berat molekul tertentu. 2000). penurunan produksi susu. harga relatif murah.PENDAHULUAN Ruminansia kecil khususnya domba sangat potensial untuk dikembangkan karena selain sebagai sumber protein hewani yang baik. seperti penggunaan antigen dari hasil ekskresisekresi H. kemudahan cara pemakaian. semakin besar kemungkinan protein tersebut imunogenik (Tizard. antigen dari ekstrak cacing dewasa (Safar et al.g) serta melakukan pencegahan yaitu menyapih anak domba seawal mungkin karena domba dewasa merupakan sumber infeksi bagi domba muda. Ostertagia sp dan Trichostrongylus sp mirip sekali satu sama lain. protein dari intestin H. Parasit dianggap sebagai penghambat dalam pembangunan peternakan. 1987). Semakin besar molekul protein eskresi-sekresi. Pemberian antelmintik untuk mengendalikan infeksi cacing harus memperhatikan efektivitas dan spektrum. mencegah pencemaran pakan dan minuman dari tinja dan menyediakan tempat yang telah didesinfeksi atau padang rumput yang tidak terinfeksi H. murah serta efek samping minimal. Profil protein ekskresi-sekresi H. wol dan terhambatnya pertumbuhan domba muda baik secara kualitatif maupun kuantitatif serta kematian domba.

Sebanyak 10 μl sampel protein ditambah laemmli buffer dengan perbandingan 2:1 kemudian dilakukan perebusan pada 100°C selama lima menit. Elektroforesis Protein Ekskresi Sekresi dengan SDS-PAGE Bahan disiapkan kemudian dibuat running gel dan dimasukkan ke dalam plat kaca.0 selama semalam. kemudian dilakukan pencucian dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali selama dua menit. gel dimasukkan ke larutan pencuci yang terdiri dari empat tahap pencucian.contortus dewasa berdasarkan berat molekul protein ekskresi-sekresi cacing H. kemudian dilakukan sentrifugasi 10. 1983 yang sudah dimodifikasi. Setelah perebusan. 1987 yang sudah dimodifikasi). Pelet yang didapatkan kemudian diresuspensi dengan PBS dan siap untuk identifikasi protein. cacing dibedakan dengan melihat adanya intestin dan uterus yang berselangseling. kemudian diberikan larutan pengembang warna. contortus invitro Seratus ekor cacing H. contortus betina dewasa dalam keadaan hidup diisolasi dari abomasum domba dan kambing yang dipotong di RPH Surabaya. Setelah pita protein terlihat maka dapat dihentikan dengan penambahan asam asetat 10%. kemudian dicuci dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali.000 rpm selama 10 menit. . METODE PENELITIAN Isolasi dan Kultivasi H. Meyer and Walker. Setelah running. Penghitungan berat molekul dilakukan dengan membandingkan standart marker. Cacing diinkubasi dalam PBS pada cawan petri dengan temperatur 37°C dan pH 7. setelah mengeras pada bagian atasnya dimasukkan stacking gel yang telah dipersiapkan. contortus dewasa. 40 mA pada chamber yang telah diisi Electrode Buffer 1x. dengan suhu 4°C. yaitu cairan yang dikeluarkan cacing sebagai sisa metabolisme dalam PBS diambil untuk isolasi protein ekskresisekresi. Cairan ekskresi maupun sekresi. Isolasi Protein Ekskresi-Sekresi Protein ekskresi-sekresi yang terdapat dalam PBS hasil kultivasi cacing diisolasi dengan penambahan amonium jenuh kemudian dicampur sampai rata dan diinkubasi pada suhu 4°C selama semalam. dimasukkan ke dalam lubang pada stacking gel yang tersedia dan dilakukan running dengan 100 volt. Setelah dicuci gel diwarnai dengan AgNO3 selama 15 menit sambil digoyang. kemudian dilakukan pencucian dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) sampai bersih. Hasil gel yang telah tampak disimpan dalam larutan gliserol 10% (Axelsen.

contortus dengan Menggunakan SDS-PAGE 12 % Rf = Jarak band dari sumuran / Panjang gel sesudah di running ∗ Marker : Panjang gel sesudah di running = 12 1.7/12 = 0.5 kDa Rf = 7.34 5.5 % 0.2/12 = 0.25/12 = 0. Rf = 1.0 μl APS 10 % 30 μl 3. 39.3 kDa 3. Rf = 1.1 ml Temed 5.12 3. 13.9 kDa Komposisi Bahan-Bahan Yang Digunakan Dalam Penelitian 1. Komposisi Phosphat Buffer Saline (PBS) NaCl 13.85/12 = 0.4 kDa 5.66 ml Tris HCl pH 6. Rf = 3. 28.5 ml Tris HCl pH 8. Protein 14.2 g) Na2HPO4 x 2H2O 8 mM (1. Komposisi Running Gel 12 % Acrilamid 2.80 ml Aquades 0. 42.679 X Y = 49.4/12 = 0.1/12 = 0.Perhitungan Fraksi Protein Ekskresi Sekresi H. Protein 30 kDa Rf = 3.80 ml . Rf = 5.2 ml Aquades 1.2 ml SDS 0. Komposisi Stacking Gel 12 % Acrilamid 0.48 Dari data marker.74.679 X Hasil : 1.7 mM (8 g) KCl 2.3 kDa 2.3 kDa Rf = 5.80 ml SDS 0.7 /12 = 0. 24.42 g) Aquades ad 1000 ml 2.28 4. Protein 20.7 mM (0. dibuat persamaan linier dimana koefisien X = Rf marker dan Y = Protein marker (kDa) ⇒ didapatkan persamaan : Y = 49.10 2.766 .8 1. Protein 45 kDa Rf = 0.9 kDa 4.8 0.5 % 1. Rf = 4.28 4.10 2.766 + (–) 74.1 kDa Rf = 4.14 3.34 5.25/12 = 0.2 /12 = 0. Protein 6.48 ∗ Sumuran I : 1.8/12 = 0.

Menambahkan butanol 5.75 ml Aquades 93. Dituangi dengan E Buffer (kira-kira 800 ml) 11.13 g SDS CH12H2SO4 10 g Aquades ad 1000 ml 5. Menyiapkan sampel (Laemmli Buffer + sampel) dimasukkan ke dalam eppendorf dan direbus dengan suhu 100 0C selama 5 menit 8. Komposisi Electrophoresis Buffer Tris (hidroksimetil) aminomethan 30.75 ml Aquades 71.0 μl APS 10 % 20 μl 4. Komposisi Pewarnaan Perak Aquades 73.4 ml AgNo3 dilarutkan dalam 4 ml Aquades 6.25 ml Diletakkan di atas shaker dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit  Pencucian II: Metanol 25 ml Asam asetat 3. 2. Mematikan listrik dan melepas agar pelan-pelan 15. Memasang listrik dengan tegangan 125 V dan 40 mA (proses running) 13. Memasukkan cetakan ke Bio Rad 10.75 ml Digoyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit .36 % 21 ml NH3 1. Semua bahan yang diperlukan disiapkan.Temed 4.5 ml NaOH 0. Memasukkan sampel ke dalam lubang comb dan menghilangkan gelembung udara dengan jarum 12. Memasukkan stacking gel ke atas cetakan running gel hingga penuh kemudian memasukkan comb ke atas stacking gel dan diinkubasi selama 25 menit 7. Membuat stacking gel 12 % (komposisi pada lampiran 2) 6. Memasukkan running gel lewat dinding kaca hingga mencapai 1 cm dari atas 4. Tahap pencucian:  Pencucian I: Metanol 25 ml Asam asetat 3. 3. melepaskan comb dan cuci dengan E Buffer 1 kali 9.29 g Glisin 144. Memasukkan agar ke dalam cawan petri yang telah berisi larutan pencuci 16. Membuat running gel 12 % (komposisi lengkap pada lampiran 2).7 % 50 μl Asam sitrat 5 % 100 μl Aquades 100 ml Cara Kerja SDS-PAGE 1. Menunggu hingga sampel turun seluruhnya 14. Setelah inkubasi selesai. Komposisi Pengembang Warna Formaldehid 3.

Pencucian III: Glutaraldehid 10 ml Aquades 90 ml  Pencucian IV: aquades @ 100 ml 3 kali selama 30 menit 17. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 1. Menambahkan gliserol 10 % (Gliserol 10 ml + aquades 90 ml)  HASIL DAN PEMBAHASAN Berdasarkan hasil penelitian dengan elektroforesis dari ekskresi-sekresi cacing Haemonchus contortus dengan metode SDS-PAGE didapatkan 5 profil protein dengan berat molekul yaitu: 42. Teknik ini biasa digunakan karena murah.9 kDa. dalam hal ini digunakan polyacrylamide.3 kDa. 1991). Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 19. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 22. . Elektroforesis dengan Acrylamid (PAGE) merupakan metode standar untuk memisahkan. sederhana. Pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE bertujuan untuk memisahkan protein dalam sampel berdasarkan berat molekul. identifikasi. 24.9 kDa. karakterisasi dan purifikasi molekul DNA/RNA (Artama. 28. 39. Memasukkan pengembang warna (komposisi pada lampiran 2) dan goyangkan selama 5 menit 20. Prinsip dasar SDSPAGE ini adalah denaturasi protein oleh sodium dodecyl sulphate yang dilanjutkan dengan pemisahan molekul berdasarkan berat molekulnya dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel. Menghentikan reaksi dengan menambahkan asam asetat 10 % 21.3 kDa. sampel yang digunakan relatif sedikit dan lokasi DNA dapat langsung diamati dengan menggunakan perak nitrat sebagai zat warna. Tahap Pewarnaan Memasukkan komposisi pewarnaan perak (lampiran 2) dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 15 menit 18.4 kDa dan 13.

yaitu: 42. sehingga dalam penelitian ini protein yang memiliki berat molekul 13.9 kDa. KESIMPULAN Berdasarkan hasil identifikasi protein ekskresi-sekresi Haemonchus contortus dengan SDS-PAGE didapatkan lima profil protein yaitu: 42. 11. makin tinggi konsentrasi gel maka pori yang terbentuk semakin kecil. Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Lastuti dkk (2001) terhadap intestin H. 4 kDa. profil protein dengan berat molekul 28. dimana tebal tipisnya pita protein yang tercat merupakan gambaran banyaknya protein yang terkandung dalam profil protein ekskresi-sekresi. contortus. 14. 28.3 kDa. Dari kelima profil protein tersebut. 41. Biasanya semakin besar berat molekulnya.Zat lain yang digunakan adalah Temed sebagai inisiator terjadinya polimerisasi dan amonium persulfat (APS) sebagai katalisator. 24. Pencucian dengan E. 24 kDa. Profil protein yang dominan adalah 19. semakin imunogenik tetapi tidak menutup kemungkinan protein dengan berat molekul kecil dapat bertindak sebagai imunogen.9 kDa.4 kDa dan 13.2 kDa. Pemberian Temed dan APS harus disesuaikan dengan kebutuhan karena apabila terlalu banyak dapat menyebabkan protein teroksidasi dan perubahan pada buffer. yang dapat digunakan sebagai dasar pengembangan reagen diagnostik dan terapi masih perlu penelitian lebih lanjut. Dari beberapa profil protein ekskresi-sekresi yang didapatkan dalam penelitian ini.4 kDa.4 kDa dan 13. 9 kDa. 24.4 kDa kemungkinan besar adalah protein yang sangat imunogenik sehingga dapat digunakan sebagai bahan diagnosa dan terapi haemonchosis.9 kDa dan 24.9 kDa. Pemilihan konsentrasi gel yang tepat juga menentukan keberhasilan pemisahan fraksi protein karena menentukan besar poripori matriks gel. Kodyman (2000) menyatakan bahwa antigen yang mengandung protein dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa merupakan antigen yang sangat imunogenik.8 kDa dan 3. didapatkan dua profil yang tercat tebal yaitu protein dengan berat molekul 28. 11. 9 kDa.9 kDa dan 24. 1987).3 kDa. yaitu: 46 kDa. Pemberian asam asetat diperlukan untuk menghentikan reaksi agar pewarnaan tidak terlalu gelap sehingga dapat terbaca. 3.4 kDa.9 kDa.6 kDa. Dari hasil penelitian tersebut dapat dikatakan bahwa kemungkinan profil protein 24 kDa berasal dari intestin H. contortus. 27. Pemakaian Laemmli buffer dalam penelitian ini bertujuan agar fraksi protein saat dirunning dapat terpisah dengan sempurna.3 kDa. didapatkan 13 profil protein. walaupun molekul besar jauh lebih baik (Tizard. 14. 28. 36 kDa. 39.4 kDa adalah profil yang tercat tebal. Hasil elektroforesis dengan metode SDS-PAGE didapatkan beberapa profil protein ekskresi-sekresi H. 4 kDa. .9 kDa.8 kDa dan 3.6 kDa. 19. 7 kDa.6 kDa.3 kDa.6 kDa. sedangkan pemakaian APS yang terlalu sedikit dapat memperlambat reaksi sehingga polimerasi akan berjalan lambat.4 kDa.4 kDa. Dari lima profil protein tersebut. contortus dewasa. 39.9 kDa dan 24.9 kDa. 3. buffer bertujuan untuk menghantarkan listrik agar cairan sampel dapat turun ke dasar plate.

selaku pembimbing pertama dan Tri Nurhajati. selaku pembimbing kedua. M.. Fedik Abdul antam.S.. M. drh. drh.S. Ismudiono. Nunuk Dyah Retno L. selaku koordinator Bagian Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.UCAPAN TERIMA KASIH Prof. M. .. Dr.S. selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.. drh. drh. Dr.

H. Parasitologi Veteriner. Australia. El-Massry. Protection in Lambs Vaccinated with H. J. Diterjemahkan oleh Gatot Ashadi. Egyp. Jakarta. Perkumpulan Pemberantasan Penyakit Parasit Indonesia. Profil Protein Intestine H. J and J. H. Tizard. Universitas Airlangga. 39-44. Soc. Gajah Mada University Press. 214. F. Huntley. Parasitol. Levine. 1998. I. Rekayasa Genetika. Academic Press Inc. 1992. J. 2000. contortus Antigens is Age Related and Corellates with IgE Rather than IgG1 Antibody. El-Rifaei and K. 30 (2): 561-571. Lastuti. D.DAFTAR PUSTAKA Abdel-Rahman. 1991. Ascaris vitulorum and Toxocara canis. O. . Harcourtbrace Jovanich Publisher. Surabaya. 1987. A. R. Parasitol. 2001. Abstrak. Lemlit. A. Meyer. Maklad. M. Protein Chromatographyc Study on Adult Ascaris lumbricoides. 1990. Parasitol. Immunol.. contortus Dewasa. and K. A. Characterization of Antigenic Property of Toxocara canis and Toxocara leonine Adults and Larvae Through Immunodiagnostic Electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot Technique. Soc. Mufasirin dan B.. 29 (2): 335-345 Kodyman. Yogyakarta. T. S. W. Blackwell Scientific Publications. Handbook of Immunoprecipitation in Gel Techniques.. PAU – Bioteknologi Universitas Gajah Mada. McKellar and J. H. 1987. N. Jan. 22 (1): 13-20. N. Scalling. Walker. Saunders Company. Koswara. D. E. 254-257. M.. Abdel-Megeed. Egyp. Immunochemical Methods in Cell and Mollecular Biology. 2000. Artama. 1983. Toxocara vitulorum and Moniezia expansa. Vanleuwen. Axelsen. Aksono. Wayan. R.. Peran Serta Masyarakat Dalam Upaya Pengendalian Penyakit Parasitik Pada Hewan. H. B. Parasite. Egyp. J. H. Soc. F. N. An Introduction of Veterinary Immunology. Prosiding Seminar Parasitologi Nasional IV. Mollecular Identity of Major Cross Reactive Adult Antigens in Fasciola gigantica. 1999. R. 417-424. Safar. E. 22 (1): 171-176. 1-95. Yogyakarta. N.