IDENTIFICATION OF EXCRETION SECRETION PROTEIN PROFILE OF THE ADULT Haemonchus contortus WITH SDS-PAGE Artha Rini Pasila Mahasiswa,

, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya ABSTRACT The aim of this research is to identify excretion secretion protein (ESP) profile of Haemonchus contortus which presented in mollecular weight. One hundred female Haemonchus contortus were isolated from sheeps and goats abomasum from Surabaya Slaughter House, worms were washed by Phosphat Buffer Saline (PBS) then incubated in PBS with pH 7,0 and temperature 37C for a night. Excretion secretion liquid that worms produced in PBS isolated with saturated ammonium, then SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamid Gel Electrophorese) method used to identified excretion secretion protein profile. Result of this research got 5 excretion secretion protein profile : 42,3 kilo Dalton (kDa); 39,3 kDa; 28,9 kDa; 24,4 kDa and 13,9 kDa. Key words : Haemonchus contortus, ESP, SDS-PAGE

PENDAHULUAN Ruminansia kecil khususnya domba sangat potensial untuk dikembangkan karena selain sebagai sumber protein hewani yang baik, harga relatif murah, cepat berkembang biak serta dapat menghasilkan pupuk, wol dan kulit sebagai komoditi ekspor yang cukup berharga. Pengembangan ternak domba dilaksanakan dengan meningkatkan populasi dan produktivitas domba diimbangi sistem pemeliharaan yang baik serta pengendalian dan pemberantasan penyakit, khususnya gangguan endoparasit. Parasit dianggap sebagai penghambat dalam pembangunan peternakan, terutama yang berhubungan dengan peningkatan populasi dan produksi ternak (Koswara, 1998). Haemonchosis merupakan penyakit parasiter yang paling sering menyerang domba. Disebabkan oleh cacing Haemonchus contortus, menimbulkan kerugian ekonomi yaitu penurunan berat badan, penurunan produksi susu, daging, kualitas kulit, wol dan terhambatnya pertumbuhan domba muda baik secara kualitatif maupun kuantitatif serta kematian domba. Pengendalian haemonchosis dapat dilakukan dengan menekan jumlah arva infektif melalui pengeringan lapangan tempat domba merumput, melakukan penghitungan telur H. contortus per gram tinja induk semang sampai batas patogen yaitu 300 butir telur per gram tinja (t.p.g) serta melakukan pencegahan yaitu menyapih anak domba seawal mungkin karena domba dewasa merupakan sumber infeksi bagi domba muda, mencegah pencemaran pakan dan minuman dari tinja dan menyediakan tempat yang telah didesinfeksi atau padang rumput yang tidak terinfeksi H. contortus untuk melahirkan (Levine, 1990). Pengendalian dapat juga ditempuh dengan memberikan pengobatan menggunakan antelmintik yang tepat. Pemberian antelmintik untuk mengendalikan infeksi cacing harus memperhatikan efektivitas dan spektrum, kemudahan cara pemakaian, murah serta efek samping minimal. Haemonchosis dapat didiagnosis dengan menemukan cacing pada saat bedah bangkai atau menemukan telur cacing pada saat pemeriksaan tinja, tetapi hal ini sulit dilakukan karena telur Haemonchus sp, Ostertagia sp dan Trichostrongylus sp mirip sekali satu sama lain, sehingga harus ditetaskan dan larva dibiarkan berkembang sampai larva stadium ke-3 yang infektif kemudian diidentifikasi (Levine, 1990). Banyak penelitian yang mengarah ke pembuatan vaksin molekuler untuk mengantisipasi problem yang ditimbulkan oleh cacing dengan menggunakan antigen dari produk cacing, seperti antigen somatik (El-Massry, 1999), antigen dari ekstrak cacing dewasa (Safar et al., 1992; Abdel-Rahman and Megeed, 2000), protein dari intestin H. contortus dewasa (Lastuti dkk, 2001) dan ekskresi-sekresi untuk pengembangan vaksin, seperti penggunaan antigen dari hasil ekskresisekresi H. contortus dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa yang merupakan protein yang sangat imunogenik (Kodyman et al, 2000). Profil protein ekskresi-sekresi H. contortus memiliki berat molekul tertentu. Semakin besar molekul protein eskresi-sekresi, semakin besar kemungkinan protein tersebut imunogenik (Tizard, 1987). Berdasarkan masalah di atas, penelitian ini bertujuan mengetahui profil protein dari cacing Haemonchus

contortus dewasa berdasarkan berat molekul protein ekskresi-sekresi cacing H. contortus dewasa.

METODE PENELITIAN Isolasi dan Kultivasi H. contortus invitro Seratus ekor cacing H. contortus betina dewasa dalam keadaan hidup diisolasi dari abomasum domba dan kambing yang dipotong di RPH Surabaya, cacing dibedakan dengan melihat adanya intestin dan uterus yang berselangseling, kemudian dilakukan pencucian dengan Phosphat Buffer Saline (PBS) sampai bersih. Cacing diinkubasi dalam PBS pada cawan petri dengan temperatur 37C dan pH 7,0 selama semalam. Cairan ekskresi maupun sekresi, yaitu cairan yang dikeluarkan cacing sebagai sisa metabolisme dalam PBS diambil untuk isolasi protein ekskresisekresi. Isolasi Protein Ekskresi-Sekresi Protein ekskresi-sekresi yang terdapat dalam PBS hasil kultivasi cacing diisolasi dengan penambahan amonium jenuh kemudian dicampur sampai rata dan diinkubasi pada suhu 4C selama semalam, kemudian dilakukan sentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit, dengan suhu 4C. Pelet yang didapatkan kemudian diresuspensi dengan PBS dan siap untuk identifikasi protein. Elektroforesis Protein Ekskresi Sekresi dengan SDS-PAGE Bahan disiapkan kemudian dibuat running gel dan dimasukkan ke dalam plat kaca, setelah mengeras pada bagian atasnya dimasukkan stacking gel yang telah dipersiapkan. Sebanyak 10 l sampel protein ditambah laemmli buffer dengan perbandingan 2:1 kemudian dilakukan perebusan pada 100C selama lima menit. Setelah perebusan, dimasukkan ke dalam lubang pada stacking gel yang tersedia dan dilakukan running dengan 100 volt, 40 mA pada chamber yang telah diisi Electrode Buffer 1x. Setelah running, gel dimasukkan ke larutan pencuci yang terdiri dari empat tahap pencucian. Setelah dicuci gel diwarnai dengan AgNO3 selama 15 menit sambil digoyang, kemudian dilakukan pencucian dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali selama dua menit, kemudian diberikan larutan pengembang warna. Setelah pita protein terlihat maka dapat dihentikan dengan penambahan asam asetat 10%, kemudian dicuci dengan aquades 100 ml sebanyak dua kali. Hasil gel yang telah tampak disimpan dalam larutan gliserol 10% (Axelsen, 1983 yang sudah dimodifikasi; Meyer and Walker, 1987 yang sudah dimodifikasi). Penghitungan berat molekul dilakukan dengan membandingkan standart marker.

Perhitungan Fraksi Protein Ekskresi Sekresi H. contortus dengan Menggunakan SDS-PAGE 12 % Rf = Jarak band dari sumuran / Panjang gel sesudah di running Marker : Panjang gel sesudah di running = 12 1. Protein 45 kDa Rf = 0,85/12 = 0.10 2. Protein 30 kDa Rf = 3,25/12 = 0,12 3. Protein 20,1 kDa Rf = 4,7 /12 = 0,28 4. Protein 14,3 kDa Rf = 5,25/12 = 0,34 5. Protein 6,5 kDa Rf = 7,2 /12 = 0,48 Sumuran I : 1. Rf = 1,2/12 = 0,10 2. Rf = 1,7/12 = 0,14 3. Rf = 3,4/12 = 0,28 4. Rf = 4,1/12 = 0,34 5. Rf = 5,8/12 = 0,48 Dari data marker, dibuat persamaan linier dimana koefisien X = Rf marker dan Y = Protein marker (kDa) didapatkan persamaan : Y = 49,766 + () 74,679 X Y = 49,766 - 74,679 X Hasil : 1. 42,3 kDa 2. 39,3 kDa 3. 28,9 kDa 4. 24,4 kDa 5. 13,9 kDa Komposisi Bahan-Bahan Yang Digunakan Dalam Penelitian 1. Komposisi Phosphat Buffer Saline (PBS) NaCl 13,7 mM (8 g) KCl 2,7 mM (0,2 g) Na2HPO4 x 2H2O 8 mM (1,42 g) Aquades ad 1000 ml 2. Komposisi Running Gel 12 % Acrilamid 2,5 ml Tris HCl pH 8,8 1,2 ml SDS 0,5 % 1,2 ml Aquades 1,1 ml Temed 5,0 l APS 10 % 30 l 3. Komposisi Stacking Gel 12 % Acrilamid 0,66 ml Tris HCl pH 6,8 0,80 ml SDS 0,5 % 0,80 ml Aquades 0,80 ml

Temed 4,0 l APS 10 % 20 l 4. Komposisi Electrophoresis Buffer Tris (hidroksimetil) aminomethan 30,29 g Glisin 144,13 g SDS CH12H2SO4 10 g Aquades ad 1000 ml 5. Komposisi Pewarnaan Perak Aquades 73,5 ml NaOH 0,36 % 21 ml NH3 1,4 ml AgNo3 dilarutkan dalam 4 ml Aquades 6. Komposisi Pengembang Warna Formaldehid 3,7 % 50 l Asam sitrat 5 % 100 l Aquades 100 ml Cara Kerja SDS-PAGE 1. Semua bahan yang diperlukan disiapkan. 2. Membuat running gel 12 % (komposisi lengkap pada lampiran 2). 3. Memasukkan running gel lewat dinding kaca hingga mencapai 1 cm dari atas 4. Menambahkan butanol 5. Membuat stacking gel 12 % (komposisi pada lampiran 2) 6. Memasukkan stacking gel ke atas cetakan running gel hingga penuh kemudian memasukkan comb ke atas stacking gel dan diinkubasi selama 25 menit 7. Menyiapkan sampel (Laemmli Buffer + sampel) dimasukkan ke dalam eppendorf dan direbus dengan suhu 100 0C selama 5 menit 8. Setelah inkubasi selesai, melepaskan comb dan cuci dengan E Buffer 1 kali 9. Memasukkan cetakan ke Bio Rad 10. Dituangi dengan E Buffer (kira-kira 800 ml) 11. Memasukkan sampel ke dalam lubang comb dan menghilangkan gelembung udara dengan jarum 12. Memasang listrik dengan tegangan 125 V dan 40 mA (proses running) 13. Menunggu hingga sampel turun seluruhnya 14. Mematikan listrik dan melepas agar pelan-pelan 15. Memasukkan agar ke dalam cawan petri yang telah berisi larutan pencuci 16. Tahap pencucian: Pencucian I: Metanol 25 ml Asam asetat 3,75 ml Aquades 71,25 ml Diletakkan di atas shaker dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit Pencucian II: Metanol 25 ml Asam asetat 3,75 ml Aquades 93,75 ml Digoyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 30 menit

Pencucian III: Glutaraldehid 10 ml Aquades 90 ml Pencucian IV: aquades @ 100 ml 3 kali selama 30 menit 17. Tahap Pewarnaan Memasukkan komposisi pewarnaan perak (lampiran 2) dan goyang dengan kecepatan 42 putaran per menit selama 15 menit 18. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 19. Memasukkan pengembang warna (komposisi pada lampiran 2) dan goyangkan selama 5 menit 20. Menghentikan reaksi dengan menambahkan asam asetat 10 % 21. Dicuci dengan aquades @ 100 ml 2 kali selama 2 menit 22. Menambahkan gliserol 10 % (Gliserol 10 ml + aquades 90 ml)

HASIL DAN PEMBAHASAN Berdasarkan hasil penelitian dengan elektroforesis dari ekskresi-sekresi cacing Haemonchus contortus dengan metode SDS-PAGE didapatkan 5 profil protein dengan berat molekul yaitu: 42,3 kDa; 39,3 kDa; 28,9 kDa; 24,4 kDa dan 13,9 kDa. Hasil selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 1.

Elektroforesis dengan Acrylamid (PAGE) merupakan metode standar untuk memisahkan, identifikasi, karakterisasi dan purifikasi molekul DNA/RNA (Artama, 1991). Teknik ini biasa digunakan karena murah, sederhana, sampel yang digunakan relatif sedikit dan lokasi DNA dapat langsung diamati dengan menggunakan perak nitrat sebagai zat warna. Pemisahan protein dengan metode SDS-PAGE bertujuan untuk memisahkan protein dalam sampel berdasarkan berat molekul. Prinsip dasar SDSPAGE ini adalah denaturasi protein oleh sodium dodecyl sulphate yang dilanjutkan dengan pemisahan molekul berdasarkan berat molekulnya dengan metode elektroforesis yang menggunakan gel, dalam hal ini digunakan polyacrylamide.

Zat lain yang digunakan adalah Temed sebagai inisiator terjadinya polimerisasi dan amonium persulfat (APS) sebagai katalisator. Pemberian Temed dan APS harus disesuaikan dengan kebutuhan karena apabila terlalu banyak dapat menyebabkan protein teroksidasi dan perubahan pada buffer, sedangkan pemakaian APS yang terlalu sedikit dapat memperlambat reaksi sehingga polimerasi akan berjalan lambat. Pemilihan konsentrasi gel yang tepat juga menentukan keberhasilan pemisahan fraksi protein karena menentukan besar poripori matriks gel, makin tinggi konsentrasi gel maka pori yang terbentuk semakin kecil. Pemakaian Laemmli buffer dalam penelitian ini bertujuan agar fraksi protein saat dirunning dapat terpisah dengan sempurna. Pencucian dengan E. buffer bertujuan untuk menghantarkan listrik agar cairan sampel dapat turun ke dasar plate. Pemberian asam asetat diperlukan untuk menghentikan reaksi agar pewarnaan tidak terlalu gelap sehingga dapat terbaca. Hasil elektroforesis dengan metode SDS-PAGE didapatkan beberapa profil protein ekskresi-sekresi H. contortus dewasa, yaitu: 42,3 kDa; 39,3 kDa; 28,9 kDa; 24,4 kDa dan 13,9 kDa. Dari kelima profil protein tersebut, profil protein dengan berat molekul 28,9 kDa dan 24,4 kDa adalah profil yang tercat tebal, dimana tebal tipisnya pita protein yang tercat merupakan gambaran banyaknya protein yang terkandung dalam profil protein ekskresi-sekresi. Menurut penelitian yang telah dilakukan oleh Lastuti dkk (2001) terhadap intestin H. contortus, didapatkan 13 profil protein, yaitu: 46 kDa; 41,2 kDa; 36 kDa; 27,4 kDa; 24 kDa; 19,6 kDa; 14,9 kDa; 11,4 kDa; 9 kDa; 7 kDa; 4 kDa; 3,8 kDa dan 3,6 kDa. Profil protein yang dominan adalah 19,6 kDa; 14,9 kDa; 11,4 kDa; 9 kDa; 4 kDa; 3,8 kDa dan 3,6 kDa. Dari hasil penelitian tersebut dapat dikatakan bahwa kemungkinan profil protein 24 kDa berasal dari intestin H. contortus. Dari beberapa profil protein ekskresi-sekresi yang didapatkan dalam penelitian ini, yang dapat digunakan sebagai dasar pengembangan reagen diagnostik dan terapi masih perlu penelitian lebih lanjut. Biasanya semakin besar berat molekulnya, semakin imunogenik tetapi tidak menutup kemungkinan protein dengan berat molekul kecil dapat bertindak sebagai imunogen, walaupun molekul besar jauh lebih baik (Tizard, 1987). Kodyman (2000) menyatakan bahwa antigen yang mengandung protein dengan berat molekul 15 kDa dan 24 kDa merupakan antigen yang sangat imunogenik, sehingga dalam penelitian ini protein yang memiliki berat molekul 13,9 kDa dan 24,4 kDa kemungkinan besar adalah protein yang sangat imunogenik sehingga dapat digunakan sebagai bahan diagnosa dan terapi haemonchosis.

KESIMPULAN Berdasarkan hasil identifikasi protein ekskresi-sekresi Haemonchus contortus dengan SDS-PAGE didapatkan lima profil protein yaitu: 42,3 kDa; 39,3 kDa; 28,9 kDa; 24,4 kDa dan 13,9 kDa. Dari lima profil protein tersebut, didapatkan dua profil yang tercat tebal yaitu protein dengan berat molekul 28,9 kDa dan 24,4 kDa.

UCAPAN TERIMA KASIH Prof. Dr. Ismudiono, drh., M.S. selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga. Nunuk Dyah Retno L., drh., M.S. selaku pembimbing pertama dan Tri Nurhajati, drh., M.S. selaku pembimbing kedua. Dr. Fedik Abdul antam, drh, selaku koordinator Bagian Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.

DAFTAR PUSTAKA Abdel-Rahman, E. H. and K. N. Abdel-Megeed. 2000. Mollecular Identity of Major Cross Reactive Adult Antigens in Fasciola gigantica, Toxocara vitulorum and Moniezia expansa. Abstrak. J. Egyp. Soc. Parasitol. 30 (2): 561-571. Artama, Wayan. T. 1991. Rekayasa Genetika. PAU Bioteknologi Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. Axelsen, N. H. 1983. Handbook of Immunoprecipitation in Gel Techniques. Blackwell Scientific Publications. Australia. El-Massry, A. A. 1999. Characterization of Antigenic Property of Toxocara canis and Toxocara leonine Adults and Larvae Through Immunodiagnostic Electrophoresis (SDS-PAGE) and Western Blot Technique. J. Egyp. Soc. Parasitol; 29 (2): 335-345 Kodyman, F. N., H. D. Scalling., M. A. Vanleuwen., S. McKellar and J. F. Huntley. 2000. Protection in Lambs Vaccinated with H. contortus Antigens is Age Related and Corellates with IgE Rather than IgG1 Antibody. Parasite. Immunol. Jan; 22 (1): 13-20. Koswara, O. 1998. Peran Serta Masyarakat Dalam Upaya Pengendalian Penyakit Parasitik Pada Hewan. Prosiding Seminar Parasitologi Nasional IV. Perkumpulan Pemberantasan Penyakit Parasit Indonesia. Jakarta. 39-44. Lastuti, N. D. R., Mufasirin dan B. Aksono. 2001. Profil Protein Intestine H. contortus Dewasa. Lemlit, Universitas Airlangga. Surabaya. Levine. 1990. Parasitologi Veteriner. Diterjemahkan oleh Gatot Ashadi. Gajah Mada University Press. Yogyakarta. 214, 417-424. Meyer, R. J and J. H. Walker. 1987. Immunochemical Methods in Cell and Mollecular Biology. Academic Press Inc. Harcourtbrace Jovanich Publisher. 1-95. Safar, E. H., El-Rifaei and K. M. Maklad. 1992. Protein Chromatographyc Study on Adult Ascaris lumbricoides, Ascaris vitulorum and Toxocara canis. J. Egyp. Soc. Parasitol. 22 (1): 171-176. Tizard, I. R. 1987. An Introduction of Veterinary Immunology. W. B. Saunders Company. 254-257.