KAJIAN TENTANG POTENSI Gynura procumbens (Lour) Merr DALAM MENGINDUKSI PERBAIKAN DNA PADA MODEL KARSINOGENESIS MULUT

PADA TIKUS PUTIH A STUDY OF DNA REPAIR INDUCTION POTENCY OF Gynura procumbens (Lour) Merr ORAL CARCINOGENESIS OF Rattus norvegicus
Dewi Agustina Fakultas Kedokteran Gigi UGM

ABSTRAK Efek antikarsinogenesis daun Gynura procumbens telah banyak dibuktikan pada berbagai jenis sel baik melalui kemampuannya untuk menghentikan proliferasi sel maupun menginduksi apoptosis. Perbaikan DNA merupakan salah satu mekanisme untuk menghentikan perkembangan penyakit keganasan. GADD45 dan PARP merupakan protein penting dalam menginduksi perbaikan DNA. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengungkap kemampuan daun G. procumbens dalam memacu perbaikan DNA melalui induksi ekspresi protein GADD45 dan PARP pada model karsinogenesis mulut yang diinduksi karsinogen kimiawi. Sejumlah 92 tikus putih Sprague Dawley jantan dibagi dalam 11 kelompok penelitian. yang terdiri dari kelompok kontrol dan kelompok yang diberi perlakuan dengan karsinogen kimiawi disertai ekstrak etanolik daun G. procumbens. Pada akhir minggu ke-36 dilakukan pemeriksaan histopatologis (H&E) dan analisis imunohistokimiawi dengan metode labelled streptavidin biotin untuk mendeteksi ekspresi GADD45 dan PARP. Analisis histopatologis menunjukkan bahwa, ekstrak etanolik daun G. procumbens berefek antikarsinogenesis mulut pada fase inisiasi dengan cara preventif (kelompok II) dan profilaksis (kelompok III). Tidak terdapat perbedaan ekspresi GADD45 dan PARP yang signifikan pada semua kelompok penelitian, termasuk pada kelompok yang ekstrak etanolik daun G. procumbens dapat berefek preventif atau profilaksis. Disimpulkan bahwa, efek antikarsinogenesis daun G. procumbens tidak melalui induksi perbaikan DNA pada model yang digunakan. Kata kunci : G. procumbens, PARP, GADD45, ekspresi, karsinogenesis

ABSTRACT Anticarcinogenic effect of G. procumbens leaves has been evidenced in various cells either related with its antiproliferative effect or apoptosis induction. DNA repair is one of mechanisms to inhibit malignancy. GADD45 and PARP are essential proteins for DNA repair. The aim of this study is to elucidate the DNA repair potency of G. procumbens leaves in chemical carcinogen induced-oral carcinogenesis. Ninety two male Sprague Dawley rats were divided into 11 groups consisting of control groups and groups treated by chemical carcinogen and ethanolic extract of G. procumbens leaves. At the end of the 36th week, histopathologic examination (H&E) and immunohistochemical analysis using labeled streptavidin biotin method to detect the expression of GADD45 and PARP were conducted. Histopathologic analysis showed that the ethanolic extract of G. procumbens leaves has an oral anticarcinogenic effect in initiation phase either through its preventive (Group II) or prophylactic effect (Group III). No significant differences of GADD45 and PARP expressions were detected in groups of study, including in groups which the ethanolic extract of G. procumbens leaves had preventive or prophylactic effect. It is concluded that the anticarcinogenic effect of G. procumbens leaves does not occur through the induction of DNA repair in the model used. Key words : G. procumbens, PARP, GADD45, expression, carcinogenesis Alamat korespondensi : Dewi Agustina, Bagian Ilmu Penyakit Mulut, FKG UGM, Jl. Denta, Sekip Utara, Yogyakarta 55281 Telp/Fax : 0274-515307 HP : 08121567238 e-mail : dewiagustina2004yahoo.com

PENDAHULUAN Di Indonesia pengobatan penyakit kanker secara tradisional dengan menggunakan tumbuh-tumbuhan sudah menjadi tradisi turun-temurun. Walaupun bukti ilmiah tentang efektifitas penyembuhannya belum banyak terungkap, namun praktek pengobatan penyakit kanker secara tradisional herbal tetap berjalan terus. Salah satu tanaman yang secara empirik telah banyak dipakai untuk obat kanker, yaitu tanaman Gynura procumbens (Lour) Merr (Indonesia : sambung nyawa; Jawa : ngokilo). Ciri utama penyakit kanker yaitu terjadi proliferasi sel yang berlebihan, di sisi lain terjadi hambatan terhadap apoptosis, diferensiasi sel maupun perbaikan DNA. Diantara gen supresor tumor yang telah banyak diidentifikasi, p53 merupakan gen yang berperan penting karena p53 merupakan salah satu regulator utama proses proliferasi, apoptosis maupun perbaikan DNA. Hambatan proses proliferasi sel, induksi apoptosis dan perbaikan DNA merupakan mekanisme pertahanan seluler untuk menghentikan perkembangan penyakit keganasan (Whyte dkk., 2001). Protein yang dihasilkan oleh p53 dapat memacu ekspresi gen-gen efektor downstream-nya seperti growth arrest and DNA damage inducible 45 (gadd45) yang berperan untuk menginduksi perbaikan DNA setelah P53 mengalami poli(ADP-ribosilasi) yang dikatalisis oleh ensim poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) (Malanga dkk., 1998). Selain itu, PARP juga berperan penting untuk terjadinya perbaikan DNA yang dilakukan oleh GADD45 (Smulson dkk., 1994). Efek antikanker maupun antikarsinogenesis daun G. procumbens telah banyak dibuktikan di Indonesia melaui penelitian in vitro (Meiyanto dan Septisetyani, 2005; Jenie dkk., 2006) maupun in vivo melalui pengamatan secara patologis anatomis dan histopatologis (Sugiyanto dkk., 1993). Hasil pembuktian tersebut mengindikasikan bahwa, daun G. procumbens mempunyai potensi untuk dikembangkan sebagai obat antikanker dan antikarsinogenesis. Efek antikarsinogenesis daun G. procumbens telah terbukti pada karsinogenesis paru, lambung

dan payudara, namun tampaknya efek tersebut perlu dibuktikan pada karsinogenesis lain. Pernyataan tersebut didasarkan pada etiologi yang berbeda untuk setiap jenis karsinogenesis kemungkinan akan memberikan mekanisme molekuler yang berbeda pula, akibatnya untuk setiap jenis karsinogenesis belum tentu memberikan efek penghambatan yang sama. Selama ini efek antikarsinogeneis daun G. procumbens belum pernah dikaji pada karsinogenesis mulut. Demikian juga sampai saat ini belum pernah ada yang mengungkap mekanisme antikarsinogenesis daun G. procumbens melalui kemampuannya untuk memacu perbaikan DNA terutama dengan melihat ekspresi protein GADD45 dan ensim poly(ADP-ribose) polymerase (PARP). Oleh karena itu tujuan penelitian ini adalah untuk mengungkap kemampuan daun G. procumbens dalam memacu perbaikan DNA melalui induksi ekspresi protein GADD45 dan ensim PARP pada model karsinogenesis mulut yang diinduksi karsinogen kimiawi. Diharapkan hasil penelitian ini dapat memberikan kontribusi ilmiah dalam mengkaji mekanisme aksi daun G. procumbens dalam menghambat karsinogenesis mulut. METODOLOGI PENELITIAN Bahan 1.Sembilan puluh dua tikus putih Sprague Dawley jantan (F54) berumur 3 minggu dengan berat badan (BB) berkisar 40 77 g dari pembiakan in-breeding (PPOM, Jakarta). Subjek dibagi dalam 11 kelompok penelitian untuk melihat efek antikarsinogenesis ekstrak etanolik daun G. procumbens baik bersifat preventif dan profilaksis dalam karsinogenesis mulut, dengan pembagian sebagai berikut. Kelompok I : Induksi 4NQO 8 minggu (kontrol positif) Kelompok II : Induksi 4NQO 8 minggu bersamaan pemberian ekstrak etanolik daun G. procumbens 10 minggu. Pemberian ekstrak dimulai 1 minggu sebelum induksi 4NQO Kelompok III: Induksi 4NQO 8 minggu. Satu minggu setelah induksi 4NQO selesai,

ekstrak etanolik daun G. procumbens mulai diberikan sampai akhir minggu ke-36 Kelompok IV: Induksi 4NQO 16 minggu (kontrol positif) Kelompok V: Induksi 4NQO 16 minggu bersamaan pemberian ekstrak etanolik daun G. procumbens 18 minggu. Pemberian ekstrak dimulai 1 minggu sebelum induksi 4NQO Kelompok VI: Induksi 4NQO 16 minggu. Satu minggu setelah induksi 4NQO selesai, ekstrak etanolik daun G. procumbens mulai diberikan sampai akhir minggu ke-36 Kelompok VII: Induksi 4NQO 24 minggu (kontrol positif) Kelompok VIII: Induksi 4NQO 24 minggu bersamaan pemberian ekstrak etanolik daun G. procumbens 26 minggu. Pemberian ekstrak dimulai 1 minggu sebelum induksi 4NQO Kelompok IX: Induksi 4NQO 24 minggu. Satu minggu setelah induksi 4NQO selesai, ekstrak etanolik daun G. procumbens mulai diberikan sampai akhir minggu ke-36 Kelompok X: Pemberian ekstrak etanolik daun G. procumbens 36 minggu (kontrol positif Gp) Kelompok XI: Tanpa perlakuan (kontrol negatif). 2.Daun G. procumbens yang dipakai adalah daun yang masih muda dipetik dari tanaman yang belum berumur satu tahun yang berasal dari ladang yang sama di Kecamatan Cangkringan, Kabupaten Sleman, Yogyakarta. Pemetikan daun dimulai 3 helai dari pucuk, dipilih daun yang besarnya hampir sama. Ekstrak etanolik daun G.procumbens dibuat dengan cara Soxhletasi dengan cairan penyarinya adalah etanol 80%. Setiap kali melakukan Soxhletasi menggunakan 300 g simplisia daun G. Procumbens yang dilarutkan dalam 1500 ml etanol 80%. 3.Karsinogen 4 nitroquinoline 1-oxide (4NQO) (Sigma Chemical Company, Australia) dilarutkan ke dalam propane-1,2diol (PD) (Sigma Aldrich Chemic Gmbh, Germany) untuk mencapai konsentrasi 0,5% (m/v); ekstrak etanolik daun Gynura procumbens (Lour) Merr yang disuspensi ke dalam 5 ml akuades; antibodi monoklonal

GADD45 (SC-6850, Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA), antibodi poliklonal PARP (RB-1516-PO, Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA), UltraVision Detection System AntiPolyvalent, UltraVision Detection System Anti-Polyvalent, Horseradish Peroxidase (HRP)/ 3-amino-9- ethylcarbazole (AEC) Kit (RTU) (TP-015-HA; Lab Vision Corporation, Fremont, CA, USA), 3,3diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (K3465, Dako Cytomation, Real Carpinteria, CA, USA), hematoksilin dan eosin (H&E) (AR157, Dako Denmark A/S, Produktionsvej 42, Glostrup, Denmark). Jalannya Penelitian Pemeliharaan subjek penelitian

Tikus putih dipelihara dalam kandang kotak plastik yang ditutup kawat kasa dalam ruangan dengan kelembaban udara 50%, ventilasi cukup, suhu 25C (dengan pendingin udara) dan penerangan 12 jam sehari. Asupan nutrisi berupa pelet AD-II (PT Japfa Comfeed Indonesia Tbk., Sidoarjo, Jawa Timur, Indonesia), air minum berasal dari air kran ad libitum diberikan melalui botol minum kaca.
Pembuatan model karsinogenesis mulut Model karsinogenesis mulut diperoleh dengan mengaplikasikan 4NQO pada mukosa lidah tikus putih sebelah dorsal tiga kali seminggu. Aplikasi 4NQO dilakukan dengan kuas gambar no. 2 satu kali usapan setiap kali induksi (0,15 0,03 mg). Pemberian ekstrak etanolik daun G. procumbens dilakukan dua kali seminggu melalui intubasi oral dengan sonde (kanul bengkok). Ekstrak disiapkan segar setiap minggu. Dosis setiap kali pemberian setara dengan 350 mg simplisia/100g berat badan tikus putih. Semua perlakuan yang diberikan pada hewan uji tidak diperlukan tindakan anestesi. Subjek hanya ditahan pada punggung dan tengkuknya sehingga diperoleh akses ke dalam rongga mulut.

Nekropsi subjek penelitian Semua tikus putih dinekropsi pada akhir masa penelitian (akhir minggu ke36) dengan cara didekapitasi yang sebelumnya tikus telah dibius dengan eter. Selanjutnya dilakukan eksisi lidah dan lidah dipotong menjadi dua pada mid line.
Pewarnaan H&E dan imunohistokimiawi Jaringan hasil eksisi difiksasi ke dalam bufer formalin 10% selama < 24 jam, selanjutnya disiapkan untuk pewarnaan H&E (Drury dan Wallington, 1967) dan imunohistokimiawi. Pewarnaan imunohistokimiawi pada penelitian ini mengacu pada metode labelled streptavidin biotin (LSAB) disertai pemanasan didalam microwave oven selama 10 menit (mengacu protokol dari Labvision Corporation, Fremont, CA, USA). Penilaian hasil pewarnaan H&E dan imunohistokimiawi Penentuan diagnosis lesi lidah dari pewarnaan H&E secara histopatologis mengacu pada "Histological Typing of Cancer and Precancer of the Oral Mucosa" dari WHO (Pindborg dkk., 1997). Penilaian hasil

pewarnaan imunohistokimiawi pada lidah hanya dilakukan pada lapisan sel-sel epitel lidah sebelah dorsal dengan mikroskop cahaya perbesaran 400 x. Dianggap terjadi imunoreaktivitas atau reaksi positif jika muncul warna merah bata (AEC sebagai kromogen) atau coklat (DAB sebagai kromogen) pada nukleus. Persentasi sel yang terwarnai positif dihitung dari 200 sel yang diamati x 100%. HASIL DAN PEMBAHASAN Dari analisis histopatologis terbukti bahwa, ekstrak etanolik daun G. procumbens berefek antikarsinogenesis pada fase inisiasi karsinogenesis mulut yang dibuktikan dengan menurunnya insidensi karsinoma sel skuamosa lidah sebesar 66,7% pada kelompok II dan sebesar 75% pada kelompok III. Efek antikarsinogenesis daun G. procumbens pada fase inisiasi karsinogenesis mulut bersifat preventif (untuk kelompok II) dan profilaksis (untuk kelompok III). Efek antikarsinogenesis daun G. procumbens tidak efektif pada fase pascainisiasi yang dibuktikan dengan penurunan insidensi karsinoma sel skuamosa lidah 11,1% dan 16,7% (Tabel 1).

Tabel 1 Persentasi masing-masing diagnosis histopatologis (H&E) berdasarkan kelompok penelitian

Kelompok Histo I II III IV V VI VII VIII IX X XI

Normal Hiperplasia Displasia KSS

0 0 0

0 50

0 37,5

0 0 0 100

0 0 0

0 0 16,7

0 0 0

0 0

0 0

0 100 0 0

50 50 0 0

16,7 37,5 25

11,1 16,7

100 33,3

100 83,3

100 88,9 83,3

Keterangan : Histo : Pemeriksaan histopatologis (H&E)

KSS : Karsinoma Sel Skuamosa

Ekspresi GADD45 terutama terdeteksi pada lapisan keratin dan pada beberapa sel di lapisan granulosum sebelah atas dari epitel lidah normal, maupun pada jaringan yang mengalami hiperplasia, displasia dan KSS terdiferensiasi baik namun sukar untuk dikuantifikasi (Gambar A). Reaksi yang positif tidak terdeteksi pada sarang-sarang tumor dari lesi KSS terdiferensiasi baik yang belum terbentuk mutiara keratin. Sel-sel tumor pada KSS terdiferensiasi sedang dari tikus putih kelompok IX menunjukkan ekspresi GADD45 yang kuat dengan persentasi ekspresi sampai 43,2% serta memberikan intensitas pewarnaan yang cukup signifikan (Gambar B). Aktivitas PARP terdeteksi cukup kuat pada sel-sel tumor yang invasif ke arah lamina propria dari lesi KSS terdiferensiasi sedang dari kelompok IX, dengan persentasi ekspresi mencapai 34,3% serta memberikan intensitas

pewarnaan yang cukup kuat (Gambar C). Namun, aktivitas PARP ini terdeteksi semakin menurun dengan semakin ke superfisial letak sel tumor, bahkan pada permukaan lesi tidak dijumpai aktivitas PARP. Aktivitas PARP juga banyak terdeteksi pada mutiara keratin dari KSS terdiferensiasi baik. Aktivitas PARP tidak terdeteksi secara nyata pada sel-sel epitel yang mengelilingi mutiara keratin (Gambar D). Sel-sel epitel dari jaringan normal, hiperplastik, displastik maupun KSS mikroinvasif tidak menunjukkan aktivitas PARP yang signifikan. Pada umumnya, tidak terdapat perbedaan ekspresi GADD45 dan PARP pada semua kelompok penelitian, termasuk pada kelompok yang ekstrak etanolik daun G. procumbens dapat berefek preventif (kelompok II) atau profilaksis (kelompok III).

Gambar A. Ekspresi GADD45 tampak pada mutiara-mutiara keratin dan lapisan granulosum sebelah atas pada KSS terdiferensiasi baik (tanda panah putih), namun ekspresi tersebut tidak dijumpai pada sarang tumor yang belum membentuk mutiara keratin (tanda panah hitam) dari tikus putih kelompok II (LSAB, DAB, 100x.).

Gambar B. Ekspresi GADD45 dijumpai pada sel-sel tumor dari KSS terdiferensiasi sedang (tanda panah putih) dan pada limfosit dan fibrosit (tanda panah hitam) dari tikus putih kelompok IX (LSAB, AEC, 400x.).

Gambar C. Aktivitas PARP terdeteksi cukup kuat pada sel-sel tumor dari KSS terdiferensiasi sedang yang invasif ke lamina propria (tanda panah) dari tikus putih kelompok IX (LSAB, DAB, 400x.).

Gambar D. Aktivitas PARP terdeteksi pada mutiara keratin dari lesi KSS terdiferensiasi baik (tanda panah hitam), namun aktivitas PARP tidak terdeteksi nyata pada sel-sel epitel yang mengelilingi mutiara keratin (tanda panah putih) dari tikus putih kelompok V (LSAB, DAB, 400x.).

Ekspresi GADD45 dan aktivitas PARP menunjukkan hasil yang sama pada semua jaringan yang diperiksa, kecuali pada KSS terdiferensiasi sedang. Terdeteksi GADD45 dan PARP pada KSS terdiferensiasi sedang dari kelompok IX tersebut kemungkinan karena proses diferensiasi sel terjadi lebih aktif, sehingga poli(ADP-ribosilasi) yang terjadi lebih banyak (DAmours dkk.,1999). Selain itu, berkenaan dengan induksi 4NQO yang sampai 24 minggu, kemungkinan masih banyak sel yang membentuk carcinogen-DNA adducts. Pembentukan adducts ini berusaha dikoreksi oleh GADD45 dengan stimulasi dari flavonoid yang terkandung di dalam daun G. procumbens, namun ternyata pemberian ekstrak etanolik daun G. procumbens tidak dapat menginduksi perbaikan DNA yang rusak akibat induksi 4NQO, walaupun efek antikarsinogenesis ekstrak etanolik daun G. procumbens baik yang bersifat preventif maupun profilaksis telah terbukti pada kelompok II dan III. Untuk dapat melakukan fungsinya dalam memperbaiki kerusakan DNA, gadd45

memerlukan bantuan ensim PARP (Smulson dkk., 1994). Hasil penelitian ini mengindikasikan bahwa, ensim PARP kemungkinan tidak teraktivasi secara semestinya yang ditunjukkan dengan munculnya imunoreaktivitas di lapisan keratin daripada di nukleus sel-sel epitel, maka menjadi rasional jika proses perbaikan DNA juga tidak terjadi. Secara teori seharusnya PARP mempunyai afinitas yang tinggi terhadap kerusakan DNA akibat induksi 4NQO, yang kemudian terjadi proses automodification untuk memberi kesempatan bagi protein yang berfungsi dalam perbaikan DNA mempunyai akses ke area DNA yang rusak untuk mengadakan perbaikan (Yung dan Satoh, 2001). Namun kiranya proses tersebut tidak terjadi, dengan kata lain efek antikarsinogenesis ekstrak etanolik daun G.

procumbens yang terbukti pada kelompok II dan III, kemungkinan tidak melalui induksi ekspresi GADD45.

Menurut Regan dan Setlow (1974), proses perbaikan DNA yang rusak akibat induksi 4NQO sama dengan proses perbaikan DNA yang rusak akibat UV. Proses tersebut dicapai melalui jalur nucleotide excision repair (NER) yang mampu mengangkat hampir semua jenis kerusakan DNA (Ogawa dkk., 2006). Di sisi lain dilaporkan bahwa, base excision repair (BER) merupakan salah satu cara bagi flavonoid untuk menunjukkan potensinya sebagai agen antikarsinogenesis (Henning, 2003), sehingga menjadi rasional jika ekstrak etanolik daun G. procumbens pada penelitian ini tidak mampu menginduksi proses perbaikan DNA. Jika berpedoman pada proses perbaikan DNA melalui NER yang hanya memerlukan waktu kurang lebih 20 jam untuk mengganti seluruh kerusakan nukleotida, maka deteksi ekspresi GADD45 dan aktivitas PARP seharusnya dilakukan segera mungkin setelah induksi dengan 4NQO atau setidak-tidaknya masih dalam fase inisiasi. Dengan melakukan deteksi ekspresi GADD45 dan aktivitas PARP pada fase akhir dari karsinogenesis, kemungkinan besar proses perbaikan DNA sulit terdeteksi. Pada umumnya, proses perbaikan DNA berlangsung pada fase awal karsinogenesis yaitu ketika pertamakali terjadi induksi kerusakan DNA dan inipun terjadi pada periode replikasi sel (Daniells, 2006; Nguewa dkk., 2003). Pada keratinosit mulut, replikasi sel dilakukan di lapisan basal dari epitel mulut, sehingga jika ada proses perbaikan DNA seharusnya ekspresi GADD45 dan aktivitas PARP terdeteksi pada sel-sel di lapisan basal. Terdeteksinya ekspresi GADD45 dan aktivitas PARP terutama pada lapisan keratin, mengindikasikan bahwa, ekspresi GADD45 dan aktivitas PARP tersebut kemungkinan tidak fungsional yang didukung dengan kenyataan bahwa, dalam penelitian ini karsinogenesis mulut tetap berlangsung secara progresif. KESIMPULAN Ekspresi GADD45 dan PARP yang terdeteksi pada penelitian ini mengindikasikan bahwa, efek antikarsinogenesis ekstrak etanolik daun G. procumbens tampaknya tidak melalui induksi perbaikan DNA pada model

karsinogenesis mulut yang diinduksi dengan 4NQO. UCAPAN TERIMAKASIH Terimakasih diucapkan kepada Pemerintah Indonesia yang telah memberikan dananya melalui BPPS dan Hibah Bersaing XII dan kepada UGM yang telah memberikan dananya melalui SDM dan LPPM sehingga penelitian ini dapat terlaksana.
DAFTAR PUSTAKA DAmours D, Desnoyers S, DSilva I and Poirier GG. 1999. Poly(ADPribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. Biochem. J. 342 : 249-268. Daniells S. 2006. Naringenin, a flavonoid found in grapefruit and oranges, helped to repair damaged DNA in cancer cells. J. of Nutritional Biochem. 17 : 89-95. Drury RAB and Wallington EA. 1967. Carletons histological technique. Oxford University Press. New York. pp. 102-113. Henning S. 2003. http://cdmrp.army.mil/script/get item. diakses pada Januari 2007. Jenie RI, Meiyanto E dan Murwanti R. 2006. Efek antiangiogenik ekstrak etanolikik daun G. procumbens (Lour) Merr pada membran korio alantois (CAM) embrio ayam. Majalah Farmasi Indonesia. 17(1) : 50-55. Malanga M, Pleschke J, Kleczkowska H and Althaus F. 1998. Poly(ADP-ribose) binds to specific domains of p53 and alters its DNA binding functions. J. Biol. Chem. 273 : 1183911843. Meiyanto E dan Septisetyani EP. 2005. Efek antiproliferatif dan apoptosis fraksi fenolik ekstrak etanolikik daun G. procumbens (Lour) Merr terhadap sel HeLa. Artocarpus. 5(2) : 7480. Nguewa PA, Fuertes MA, Alonso C and Perez JM. 2003. Pharmacological modulation of Poly(ADP-ribose) Polymerase-mediated cell death : Exploitation in cancer chemotherapy. Mol. Pharmacol. 64 : 1007-1014. Pindborg JJ, Reichart PA, Smith CJ, van der Waal I and Sobin LH. 1997. World Health Organization International Histological Classification of Tumours : Histological Typing of Cancer and Precancer of the Oral Mucosa, 2nd ed. Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. pp. 1-40. Ogawa K, Masutani M, Kato K, Tang M, Kamada N, Suzuki H, Nakagama H, Sugimura T and

Shirai T. 2006. Parp-1 deficiency does not enhance liver carcinogenesis induced by 2amino-3-methylimidazo [4,5-f] quinoline in mice. Cancer Lett. 236(1) : 32-38. Regan JD and Setlow RB. 1974. Two forms of repair in the DNA of human cells damaged by chemical carcinogens and mutagens. Cancer Res. 34 : 3318-3325. Smulson M, Istock N, Ding R and Cherney B. 1994. Deletion mutants of poly(ADP-ribose) polymerase support a model of cycle association and dissociation of enzyme from DNA ends during DNA repair. Biochemistry. 33 : 6186-6191. Sugiyanto, Sudarto B dan Meiyanto E. 1993. Efek penghambatan karsinogenisitas benzo(a)piren oleh preparat tradisional tanaman Gynura sp. dan identifikasi awal senyawa yang berkhasiat. Laporan Penelitian P4M DitJen DikTi. Fakultas Farmasi UGM. Yogyakarta. Whyte DA, Broton CE and Shillitoe EJ. 2002. The unexplained survival of cells in oral cancer : what is the role of p53 ? J Oral Pathol Med. 31 : 125-133. Yung TMC and Satoh MS. 2001. Functional competition between poly(ADP-ribose) polymerase and its 24-kDa apoptotic fragment in DNA repair and transcription. J. Biol. Chem. 276(14) : 11279-11286.