Kloning Molekul dan Karakterisasi cDNA Reseptor Dectin-1 pada Sepasang Makrofag pada Kerbau

ABSTRAK Dektin-1 suatu anggota lektin tipe-C dari keluarga reseptor pengenalan patogen terutama dinyatakan pada sel-sel dendritik dan makrofag. Pada pelajaran ini, cDNA reseptor dektin-1 telah digolongkan menggunakan makrofag RNA Kerbau dan dirancang utama dikenal urutan dektin-1 dari sapi dan domba. cDNA telah disintesis menggunakan kebalikan transkriptasi dan digunakan untuk amplifikasi dektin-1 dua Bubalus bubalis yang tumpang tindih Dectin-1 anggota keluarga lektin tipe-C patogen pengakuan reseptor terutama dinyatakan pada sel dendritik dan makrofag. Dalam hal ini studi, cDNA dectin-1 reseptor telah ditandai menggunakan Bubalus bubalis macrophage RNA dan primers dirancang dari dikenal dectin-1 urutan sapi dan domba. cDNA disintesis menggunakan transkriptase dan digunakan untuk amplifikasi dua Bubalus bubalis dectin-1 tumpang tindih fragmen panjang 410 & 619 bp. Urutan tumpang tindih dari 189-410 dihapus dan pembacaan terbuka frame (ORF) adalah dianalisis. Analisis dectin-1 ORF urutan menunjukkan bahwa ia memiliki 97.9 persen dari Homologi pada tingkat nukleotida dan 96.5, Homologi 96,0 persen di tingkat asam amino dengan Bos taurus dectin-1 AY937382, BC102340 congeners masing-masing. ORF spesies kedua terdiri dari 606 nukleotida encoding protein 201 asam amino. Kerbau dectin-1 menunjukkan 13 nukleotida substitusi sedangkan substitusi asam amino 7 dan 8 bila dibandingkan dengan Bos Taurus AY937382, BC102340 congeners masing-masing. Analisis filogenetik pohon urutan dectin-1 yang tersedia menunjukkan bahwa dectin-1 dari kerbau dan sapi berkaitan erat.

1.Pendahuluan
Sistem kekebalan tubuh melindungi organisme dari infeksi oleh patogen. Sistem ini terdiri dari kekebalan bawaan dan adaptif. Dalam kekebalan bawaan, pengakuan mikroba didasarkan pada non-clonally didistribusikan reseptor yang mengenali tertentu molekul pola di mikroba yang tidak ditemukan dalam diri-jaringan. Reseptor ini yang ditunjuk sebagai pola pengakuan reseptor (PRR) dan pola molekul yang ditunjuk sebagai patogen terkait molekul pola (PAMPs) [1]. Satu keluarga PRRs ditemukan di antigen menyajikan sel-sel ini disebut lectins tipe-C [2, 3]. Istilah CTLD (tipe-C lektin domain) awalnya diperkenalkan untuk menggambarkan karbohidrat-mengikat modul di CTLs ini [4, 5]. Reseptor ini dikenal untuk membantu dalam fagositosis mikroba, antigen pengolahan dan presentasi [6]. Dectin-1 (CLEC7A, CLECSF12, reseptor glucan; BGR), adalah tipe II transmembran reseptor yang mengandung satu ekstraseluler CTLD, leher tangkai, transmembran domain dan ITAM (Immunoreceptor aktivasi berbasis tirosin motif) dalam sitoplasma ekor [7]. Itu reseptor utama yang terlibat dalam pengakuan -1, 3 terkait glucans. Dectin-1 CTLD mengikat -glucans melalui atipikal interaksi yang tidak memerlukan kalsium [8-11]. -glukan mengikat situs dectin-1 adalah alur dangkal yang terletak pada permukaan protein, dan ditentukan oleh Trp221 dan His223 [8]. Pengakuan terhadap patogen oleh dectin-1 merangsang fagositosis oksidatif meledak, neutrofil degranulasi, produksi sitokin dan chemokines [12]. Selain itu, dectin-1 disarankan untuk bertindak sebagai T-sel costimulator. Ia berinteraksi dengan Tlymphocytes di sebuah situs yang berbeda dari situs mengenali -glucan. Mengikat ini merangsang produksi IFN, aktivasi dan proliferasi di sel T [7, 14, 15]. Dectin-1 dinyatakan sebagai atau dibumbui isoforms. Ekspresi pada berbeda myeloid sel. bervariasi dan adalah spesies tertentu [7, 10, 16-19]. Pada tahun 2006, ekspresi pola dectin-1 pada ternak sel kekebalan adalah melaporkan [20]. Karena kurangnya informasi tentang ini PRR antijamur yang penting di buffalo, kami melaporkan di sini karakterisasi reseptor dectin-1 cDNA menyatakan pada makrofag dari Buffalo (Bubalus bubalis).

2.Metode
2.1 Limfosit budaya Darah dikumpulkan yaitu dari rupanya sehat kerbau. Limfosit dipisahkan menggunakan Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, USA) menurut produsen protokol. Sel-sel yang dilarutkan dalam RPMI-1640 (Sigma Aldrich, USA) pada kepadatan 2 x Media 10 7 sel/ml yang dilengkapi dengan 15% FCS, penisilin (100 IU/ml) dan Streptomisin (100g/ml). Sel-sel yang kemudian dibagikan dalam 24 juga budaya piring (Kidung-KIDUNG, USA). Pelat dipindahkan ke CO2 inkubator di 37C dan 5% CO2 18 jam. The pelengkap media berubah 18 setiap jam. Pada 6 hari, mayoritas sel disulap menjadi makrofag [21]. 2.2 Total RNA isolasi dan analisis Total RNA dari makrofag diasingkan menggunakan REAGEN TRI (MRC, USA) menurut produsen protokol. Akhirnya, pelet adalah dilarutkan dalam 0,1% DEPC diperlakukan air suling. Kemurnian terisolasi RNA Diperiksa oleh A260 / A280 dan kuantifikasi dilakukan Berdasarkan absorbansi di 260 nm. RNA disimpan di - 70C. 2.3 RT-PCR RT-PCR dilakukan untuk sintesis untuk rantai pertama dari cDNA menggunakan kembali AidTMRT-PCR kit (Fermentas, USA) menurut produsen protokol. Dectin-1 spesifik primers untuk pertama fragmen (410bp) 5'GGAACTCAGTAGAACAATGGAATA3 ', 5'AATGATCAGGCTGGGA AGACAC3 'dan kedua fragmen (619bp) 5'GCTGTGAC TCTGGGCATTTT3', 5 'AAGT CTTCCATCCTGTTTCTCA3' yang dirancang oleh membandingkan urutan diterbitkan Bos taurus (aksesi No - BC102340, aksesi No AY937382) dan Ovis aries (aksesi No-Urutan cDNA AM167930). l disintesis sebagai template dalam Produk yang diinginkan yang diperkuat oleh siklus 30 PCR menggunakan cDNA 3 l 10 x Taq buffer (mengandung Mg2 +), 25pmol setiap primer dan shock 5U Taq DNA Polymerase(Fermentas).l reaksi yang mengandung 550 The PCR siklus terdiri dari 45 sec di 94C, pelunakan suhu 50C untuk pertama fragmen dan 52C untuk kedua fragmen dan 1 menit ekstensi di 72C. PCR reaksi telah dilakukan pada Eppendorf Mastercycler Personnal, Jerman. 2.4 Cloning dan urutan analisis Produk diperkuat ditahirkan menggunakan DNA pemurnian kit (QIAGEN, Jerman). Dimurnikan PCR produk yang kloning di pGEMTEasyTM kloning vektor (Promega, Amerika Serikat di molar jatah bandwith 3:1 di 4C dan kemudian berubah menjadi strain baru disiapkan E. Coli DH5 sel-sel yang kompeten. Klon rekombinan dipilih dengan menggunakan skrining biru/putih pada Xgal (25g/ml) / IPTG (25g/ml) / Ampicillin (50g/ml) LB piring. Klon telah dikonfirmasi oleh EcoRI pembatasan enzim pencernaan. Tiga positif klon dipilih untuk sequencing di kedua arah untuk setiap fragmen. Dectin-1 cDNA urutan kerbau dianalisis menggunakan software Lasergene (DNA Bintang Inc, USA). Urutan yang digunakan untuk perbandingan yang diambil dari 'EMBL' data bank CD serta dari NCBI website. Spesies digunakan dalam perbandingan dan aksesi nomor dectin-1 sesuai urutan adalah sebagai berikut: ternak (AY937382 & BC102340), domba (AM167930), manusia (AF400596), monyet (NM_001032943), simpanse (XM_528732) dan tikus (AY534909).

3.Hasil

3.1 RNA konsentrasi, amplifikasi g dari sel-sel 15 x 105. Konsentrasi total RNA selular yang terisolasi dari Buffalo makrofag ditemukan untuk menjadi 6.0 A260 / A280 ditemukan untuk menjadi 2.1 yang menunjukkan kemurnian tinggi RNA persiapan. Integritas diperiksa pada 1% agarose gel Elektroforesis dan pola tiga-band standar sesuai dengan 28, 18 dan 5S diamati. Optimal PCR pelunakan suhu untuk dectin-1 primers ditemukan untuk menjadi 50C & 52C untuk fragmen pertama dan kedua masing-masing. Ukuran PCR produk dalam 1% agarose gel kapal selam Elektroforesis ditemukan untuk menjadi 410 & 619 bp (ara: 1a & 1b).

3.2 Urutan analisis Klon pGEMT-EasyTM adalah sequencing untuk setiap fragmen dan urutan lengkap cDNA 773 nukleotida (Gbr.2) adalah dibentuk setelah penghapusan urutan dari 189-410 yang tumpang tindih. Hal ini juga diperkuat dengan menggunakan program SeqmanII Lasergene perangkat lunak (DNA bintang Inc, USA) dan gen Tool lite 1.0.

Gambar. 2 cDNA urutan dan urutan asam amino diduga dari Dectin-1 dari bubalis Bubalus. Residu Cyteine berwarna biru. CTLD adalah terletak antara 68-197. BLAST dilakukan untuk urutan ini dalam database NCBI. Urutan menunjukkan kemiripan dengan Dectin-1 urutan dari yang lain spesies, yang menunjukkan bahwa urutan yang diperoleh adalah kerbau Dectin-1. Urutan telah disampaikan kepada NCBI (Aksesi Nomor EF636900). ORF wilayah kerbau Dectin-1 terdiri dari 606 nukleotida dan mengkode protein dari 201 asam amino (ABR24825). ORF ini selaras menggunakan program Megalign dari Lasergene software (DNA bintang Inc, USA), dan Mega 3.1. keselarasan dalam Program Megalign dilakukan dengan menggunakan metode CLUSTALW. Gambar. 3 Dectin-1 orf keselarasan dan pohon filogenetik pada tingkat nukleotida menggunakan program Megalign dari Lasergene software (DNA bintang Inc, USA).

Kerbau Dectin-1 menunjukkan homologi (Gbr.3) 97,9% dengan ORF ternak-1 Dectin urutan. Selanjutnya, kerbau Dectin-1 ORF menunjukkan homologi homologi 51,2% dengan domba Dectin-1 ORF (AM167930). Di sisi lain, kerbau Dectin-1 ORF menunjukkan homologi 80,7% dengan manusia Dectin-1 ORF (AF400596), 80,4% dengan monyet Dectin-1 ORF (NM_001032943), 80,5% dengan simpanse Dectin-1 ORF (XM_528732) dan homologi 48,0% dengan mouse Decin-1 ORF (AY534909). Perbandingan kerbau dan sapi Dectin-1 urutan mRNA menunjukkan bahwa ada 13 substitusi. Massa dihitung dari protein yang dikode adalah 22,702 KDa dengan titik isoelektrik dari 5,82. Ada 7 dan 8 substitusi asam amino pada posisi yang berbeda dibandingkan dengan urutan asam amino ternak sesuai dengan AY937382, BC102340. 193 asam amino dilestarikan antara ternak dan kerbau Dectin-1 urutan. Residu sistein delapan kerbau Dectin-1 pada posisi C37, C54, C74, C85, C102, C174, C187 dan C195 yang ditemukan melekat dalam semua Dectin-1 urutan dianalisis dari spesies yang berbeda. CTLD itu urutan ditemukan 68-197 dan dengan motif WIGL dilestarikan diposisikan 134-137. The LLR (wilayah lingkaran Panjang) terlibat dalam karbohidrat mengikat dan domainswapping dimerisasi [22-26] terletak dari Arg139-Asn173 (Gambar 2). Gambar. 4 Dectin-1 keselarasan dan pohon filogenetik pada tingkat asam amino menggunakan program Megalign dari Lasergene software (DNA bintang Inc, USA). Dectin-1 pada tingkat asam amino menunjukkan (Gambar 4) 96,5, 96,0 persen homologi dengan ternak Dectin-1 (AY937382, BC102340) dan 72,6, 72,6, 71.6,59.7 dan 60,3 persen homologi dengan simpanse, manusia, monyet, tikus dan domba Dectin-1 masing-masing. Wilayah CTLD menunjukkan 96,2, 95,4 95,4, 76,2, 76,2, 76,2, 74,6, 58,9, 87,3, persen 75.4,75.4 identitas dengan urutan protein sapi AY937382, BC102340, NM_001031852, urutan manusia AF400596, AF400599, AY026770, Monyet urutan NM_001032943, mouse urutan AY534909, domba urutan AM167930 dan urutan simpanse XM_528732.2, XM_001144825 masing. Pada pohon filogenetik disusun berdasarkan urutan nukleotida, kerbau Dectin-1 ditemukan pada kelompok ternak dan yg berhubung dgn domba urutan. Urutan manusia dan simpanse setiap musim gugur dalam satu kelompok dan urutan tikus jatuh dalam kelompok terpisah dan lebih jauh dibandingkan dengan kelompok manusia. Berdasarkan urutan asam amino, manusia, simpanse dan monyet Dectin-1 urutan jatuh dalam satu kelompok. Urutan kerbau berkaitan erat dengan urutan, ternak AY937382 BC102340 sedangkan domba dan mouse Dectin-1 setiap urutan jatuh dalam kelompok terpisah. 4. Diskusi Makrofag merupakan garis pertama sudah ada pertahanan terhadap invasi mikroorganisme yang mengekspresikan berbagai patogen spesifik reseptor pada permukaannya. Reseptor ini membantu dalam fagositosis dan penghapusan ligan-bantalan molekul atau organisme. C-jenis

lektin (CTLs) diekspresikan pada makrofag dan antigen-penyajian sel (APC). Dectin-1 anggota dari C-jenis reseptor lektin keluarga telah terbukti memainkan peran penting dalam pengakuan jamur dan kekebalan terhadap patogen. Jenis respon setelah pengakuan patogen tergantung pada stadium jamur, kompleksitas glucan dan jenis sel yang terlibat. Dalam penelitian ini, kerbau Dectin-1 cDNA berhasil kloning dan sekuensing. Dalam studi saat ini wilayah ORF dari urutan kerbau Dectin-1 cDNA memiliki homologi 97,9% dengan Bos Dectin-1 taurus urutan (Aksesi No-AY937382, BC102340). Dengan demikian, kerbau Dectin-1 cDNA ditemukan dekat dengan ternak Dectin1 urutan dan jauh dari urutan tikus AY534909 yang memiliki hanya 48,0% kesamaan. Kerbau Dectin-1 ORF menunjukkan homologi homologi 51,2% dengan domba Dectin-1 ORF (AM167930). Pada amino kadar asam kesamaan persen ditemukan 96,5, 96,0 dengan Bos Dectin-1 urutan taurus AY937382, BC102340 masing jauh dari urutan tikus AY534909 yang memiliki kemiripan 59,7%. Kerbau Dectin-1 menunjukkan homologi dari 60,3% dengan domba Dectin-1 pada tingkat asam amino (AM167930). Dari 13 substitusi nukleotida antara kerbau dan sapi Dectin-1, 8 nukleotida substitusi mengakibatkan substitusi asam amino pada protein yang sesuai. Substitusi pada posisi 21,, 123 321, 399, 477, 534 tidak mempengaruhi produk akhir diterjemahkan, karena ini adalah posisi goyangan. Posisi yang mengakibatkan perubahan asam amino ternak G88, A178, C223, C322, T364, A422, A499 dan T566 (urutan hanya BC102340) digantikan oleh kerbau A88,, G178 T223, A322, G364, G422, G499 dan C566 masing. Perubahan asam amino adalah sebagai berikut sapi V30, I60, P75, H108, S122, Q141, E167 dan V189 (urutan hanya BC102340) digantikan oleh I30,, V60 S75, N108, A122, R141, K167 dan A189 di buffalo Dectin-1. Amino hidrofobik asam Valin, Isoleusin, valin pada posisi 30, 60, 189 sapi yang digantikan oleh hidrofobik asam amino Isoleusin, Valin dan Alanin masing. Imino asam prolin pada posisi 75 digantikan oleh serin kutub. Prolin yang terlibat dalam pembentukan berbelit, dan diganti

serin mungkin dapat mempertahankan kink dengan pembentukan ikatan hidrogen dengan beberapa asam amino lainnya. Dua kutub asam amino Serine dan Glutamine (122, 141) digantikan oleh Alanin hidrofobik dan Arginine dasar masing-masing. Histidin asam amino dasar digantikan oleh Aspargine polar (108) dan glutamat asam amino asam digantikan oleh dasar Lysine (167). The CTLD yang terlibat dalam patogen pengakuan urutan itu ditemukan 68-197 [13] dan LLR dari Arg139-Asn173 [5]. The WIH residu yang membentuk situs pengikatan yang ditemukan dilestarikan pada posisi 176-178. Wilayah CTLD menunjukkan kesamaan tertinggi 96,2 persen dengan ternak AY937382 dan ditemukan kurang serupa dari urutan tikus AY534909 58,9 persen identitas. 193 asam amino dilestarikan antara ternak dan kerbau Dectin-1sequences. Residu sistein delapan kerbau Dectin-1 termasuk C187 diperlukan untuk ekspresi permukaan ini molekul ditemukan dilestarikan [8]. Selain itu, para WIGL kekal [5] juga ditemukan untuk hadir di buffalo Dectin-1 pada posisi 134-137. Filogenetik pohon juga menunjukkan bahwa kerbau Dectin-1 jatuh pada kelompok ternak. Dectin-1 adalah reseptor utama terhadap patogen jamur dan studi ini memberikan informasi dasar untuk penelitian lebih lanjut mengenai hal ini reseptor di buffalo. Penelitian lebih lanjut diarahkan terhadap ekspresi sel tertentu dari Dectin-1 dan respon terhadap berbagai infeksi jamur kerbau yang diperlukan untuk pengembangan terapi imunomodulator untuk spesies ini. 5. Kesimpulan Analisis Dectin-1 urutan ORF mengungkapkan bahwa ia memiliki 97,9 persen homologi pada tingkat nukleotida dan 96,5, 96,0 persen homologi di tingkat asam amino dengan Bos Dectin-1, taurus AY937382 BC102340 congener masing. ORF dari kedua spesies terdiri dari 606 nukleotida pengkodean protein dari 201 asam amino. Buffalo Dectin-1 menunjukkan 13 substitusi nukleotida sedangkan 7 dan 8 asam amino substitusi bila dibandingkan dengan Bos, taurus AY937382 BC102340 congener masing. Filogenetik pohon analisis tersedia Dectin-1 urutan menunjukkan bahwa Dectin-1 kerbau dan sapi yang erat kaitannya.

Google Terjemahan untuk Bisnis:Perangkat PenerjemahPenerjemah Situs Web