Isolasi & Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Yoghurt

Oleh: 1. Tifani Istiqomah (101810401001) 2. Rion Faizah Muammaroh ( 101810401002) 3. Davidly Kurniawan (101810401013) 4. Mirza Nuryadi (101810401048) 5. Syafiq Ubaidillah (111810401015) 6. Zaenal Mahmudi (111810401050)

BAL ( Bakteri Asam laktat)

Adalah kelompok bakteri yang memiliki kemampuan untuk fermentasi glukosa (karbohidrat) menjadi asam laktat. Berdasarkan tipe fermentasinya, BAL dibagi dua yaitu : homofermentatif dan heterofermentatif. Ciri umum BAL : gram positif, katalase negatif, dan tidak membentuk spora.

Isolasi BAL dari Yoghurt

GYP broth 200 ml Na Azieda Shaker 24 jam 100 rpm 1000 l 10-1 Garfis 900l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 100 l 2x 2x 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8

yoghurt

GYP + CaCO3

Pemurnian
10-2 10-4 10-6 10-8

2x

2x

Streak plate kuadran ( diambil 5 koloni yang ukurannya berbeda)

Na Y1 Y2 Y3 Y4 Y5

Y1

Y2

Y3

Y4

Y5

Dilakukan beberapa uji

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Uji bentuk & rangkaian sel, Uji gram, Uji asam GYP broth Uji suhu (4o C, 300 C, 370 C, 470 C) GYP miring Uji Gas ( fisologi fermentasi ) media cair + tabung durham ( 5 tabung) Uji katalase Uji pH GYP miring Uji motilitas GYP tegak Uji dekstran GYP tegak

Uji Katalase
Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2.Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob dapat menguraikan zat toksik tersebut.

Metode Uji Katalase

Y1 Y2 Y3 Y4 Y5

- Diteteskan 2- 3 tetes H2O pada gelas objek. - Diberi 2-3 ose isolat - Ditesi dengan larutan H2O2 - Diamati adanya gelembung yang terbentuk

 Dari uji katalase didapatkan kesimpulan bahwa isolat Y1, Y3, Y4 adalah katalase positif terbukti dengan terbentuknya gelembung gas, sedangkan Y2 dan Y5 adalah katalase negatif .

Uji Gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu atau Kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri gram negative akan berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.

Tujuan: Tujuan dari dilakukan uji pewarnaan gram, bentuk, dan rangkaian sel adalah: - Untuk mengetahui jenis bakteri tersebut termasuk gram positif atau gram negatif. - Untuk mengetahui bentuk sel dan rangkaian sel bakteri.

Metode Kerja
Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam praktikum uji Gram, bentuk, dan rangkaian sel adalah tabung reaksi, jarum ose, obyek glas dan cover glas, pembakar bunsen, mikroskop, camera. Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum uji Gram, bentuk, dan rangkaian sel meliputi media GYP broth, alkohol 70%, aquades, larutan kristal violet (gram A), larutan Iodin (gram B), larutan alkohol (gram C), dan larutan safranin (gram D).

Prosedur Kerja

Y1

Y2

Y3

Y4

Y5

GYP broth
Y1 Y2 Y3 Y4 Y5

Obyek glass

Pengecatan Gram

Hasil Pengamatan

Gambar 1. Isolat Y1
Keterangan: -Bentuk sel coccus -Warna sel ungu -Rangkaian sel rantai

Gambar 2. Isolat Y2
Keterangan: -Bentuk sel coccus -Warna sel ungu -Rangkaian sel tetrad.

Gambar 3. Isolat Y3
Keterangan: Bentuk sel coccus Warna sel ungu Rangkaian sel rantai Tidak berspora

Gambar 4. Isolat Y4
Keterangan: Bentuk sel coccus Warna sel ungu Rangkaian sel tetrad Tidak berspora

Keterangan:
Bentuk sel coccus Warna sel ungu Rangkaian sel rantai Tidak berspora

Gambar 5. Isolat Y5

Uji KOH 10% Prosedur pewarnaan gram dinilai relatif sulit dalam prakteknya. Selain sukar memutuskan warna ungu atau merah, cara ini juga membutuhkan banyak biaya, waktu, reagen harus diganti secara berkala dan seringkali berantakan.
Metode Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam uji KOH meliputi pembakar bunsen, jarum inokulum, obyek glass dan cover glass, tusuk gigi, pipet tetes steril. Bahan-bahan yang digunakan dalam uji KOH meliputi biakan bakteri, alkohol 70%, larutan KOH 10%, aquades steril.

Uji KOH 10%

Prosedur Kerja
Teteskan 3% KOH cair pada slide (+/- 10 ul). Transfer sejumlah dari kultur ke tetesan KOH menggunakan jarum inokulum Aduk sampai sempurna Jika suspensi menjadi berlendir dalam waktu 5-60 detik maka dinyatakan sebagai gram (-). Untuk mengetahuinya ujung inokulum diangkat-angkat +/- 1 cm dari slide. Jika tidak terdapat lendir dinyatakan sebagai gram (+) .

Gambar 6. Prosedur Kerja Uji KOH 10%

Hasil Uji KOH 10%

Berdasarkan ada atau tidaknya lendir didapatkan hasil: Isolat Y1 gram positif (+) Isolat Y2 gram positif (+) Isolat Y3 gram positif (+) Isolat Y4 gram positif (+) Isolat Y5 gram positif (+)

Kesimpulan:
Dari hasil uji gram dan uji KOH didapatkan hasil isolat Y1, Y2, Y3, Y4, dan Y5 termasuk bakteri gram positif. Dibuktikan dari uji gram yang memiliki ciri bentuk sel coccus, warna sel ungu, dan tidak berspora. Sedangkan hasil dari uji KOH tidak terdapat lendir pada suspensi yang membuktikan bahwa isolat bakteri tersebut tergolong dalam bakteri gram positif. Dari hasil pengamatan uji gram didapatkan juga Isolat bakteri Y1, Y2, Y3, Y4, dan Y5 memiliki bentuk coccus. Isolat Y1, Y3, dan Y5 memiliki rangkaian sel untai sedangkan Y2 dan Y4 memiliki rankaian sel tetrad.

Pembentukan Dekstran dari Sukrosa

Dekstran merupakan hasil sintesis terhadap sukrosa oleh bakteri Leuconostoc mesenteroides. Pembentukan dekstran dari sukrosa dideteksi dengan menumbuhkan kultur pada media sukrosa-yeast ekstrakpepton (SYP) agar. Produksi dekstran ditunjukan dengan munculnya kenampakan berlendir di sekitar koloni.

Tujuan - Tujuan dari dilakukan uji biokimia pengujian dekstran adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri menghasilkan dekstran dari sukrosa.

Metode Kerja

Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam uji dekstran ini meliputi pembakar bunsen, jarum inokulasi. Bahan-bahan yang digunakan dalam uji dekstran ini meliputi biakan bakteri, media sukrosa-yeast ekstrak-pepton (SYP) agar, camera.

Prosedur Kerja
Y1 Y2 Y3 Y4 Y5

Diinokulasi secara tusukan 1 ose

Y1 Y2 Y3 Y4 Y1 Y5 Y4 Y2 Y3

Y5

media SYP

Ulangan ke-1

Ulangan ke-2

Diamati apakah terdapat lendir di sekitar koloni

Hasil Pengamatan

Gambar 7. Hasil Uji Dekstran ulangan I

Gambar 8. Hasil Uji Dekstran ulangan II

Kesimpulan

Dari hasil uji biokimia: pembentukan Dekstran dari Sukrosa didapatkan hasil bahwa isolat Y1, Y2, Y3, Y4, dan Y5 pada ulangan 1 dan ulangan 2 memiliki sifat mampu merombak sukrosa menjadi dekstran yang merupakan salah satu karakteristik dari Bakteri Asam Laktat (BAL).

Uji gas
Y1 Y2 Y3 Y4 Y5

5ml GYP cair

- Kultur ditumbuhkan pada 5ml GYP cair + tabung durham (5 tabung) lalu diinkubasi selama 24 jam.

- Hasil : semua kultur bersifat homoferment atif / tidak menghasilkan gas.

Uji motilitas
Motilitas adalah salah satu ciri mahluk hidup, begitu pula dengan mikroorganisme, namun alat geraknya masih sederhana berupa flagella atau cilia. Dilakukan dengan inokulasi tusuk isolat BAL pada GYP agar lunak tegak + CaCO3 (di dasar) lalu diinkubasi selama 24 jam.

Hasil : semua positif (+) motil

Metode

GYP cair Diamati tingkat kekeruhan setiap 2x24 jam. 3xpengamatan.

dititra si

Setiap isolat diinokulasikan ke dalam media GYP Broth. Dari GYP Broth diinokulasikan ke dalam 11 sumber karbon berbeda yaitu: mannosa, glukosa, fruktosa, galaktosa, sorbitol, laktosa, xylosa, sukrosa, cello, pati, dan mannitol. Isolat yang memiliki tingkat kekeruhan yang tinggi selanjutnya dilakukan uji asam dengan menggunakan titrasi

Tingkat Kekeruhan Isolat pada setiap sumber karbon

4.5

Tingkat Kekeruhan Isolat pada setiap sumber karbon

3.5

sumber karbon fruktosa sumber karbon mannosa sumber karbon galaktosa

2.5

sumber karbon sorbitol sumber karbon pati

sumber karbon laktosa sumber karbon sukrosa sumber karbon glukosa

1.5

sumber karbon xylosa sumber karbon mannitol

sumber karbon cello

0.5

0 I II III I II III I II III I II III I II III

y1

y2

y3

y4

y5

Uji Kandungan Asam dengan Titrasi

Ditetesi indikator BTB

Ditetesi NaOH 0.1%

Prinsip Titrasi
Titrasi asam basa berdasarkan reaksi penetralan. Kadar larutan asam ditentukan dengan menggunakan larutan basa dan sebaliknya. Titran ditambahkan titer sedikit demi sedikit sampai mencapai keadaan ekuivalen (secara stoikiometri titran dan titer tepat habis bereaksi). Pada saat titik ekuivalen ini maka proses titrasi dihentikan. Titik ekuivalen pada titrasi asam basa ditentukan dengan memakai indikator asam basa. Indikator ditambahkan pada titran sebelum proses titrasi dilakukan. Indikator ini akan berubah warna ketika titik ekuivalen terjadi

Uji Asam Menggunakan Titrasi (Jumlah As.Laktat)

9 8 7

6 y1 y2 4 y3 y4 3 y5

0 mannosa glukosa fruktosa galaktosa sorbitol laktosa sumber karbon xylosa sukrosa cello pati mannitol

KESIMPULAN
Berdasarkan data yang ada, dapat disimpulkan bahwa setiap isolat BAL mampu menghidrolisis sumber karbon yang berbeda dilihat dari jumlah asam laktat yang dihasilkan
Y1 Sukrosa, Manitol Y2 Laktosa Y3 Mannosa, Sorbitol Y4 Glukosa Y5 Sukrosa

Pengujian pH dan Suhu Identifikasi Bakteri Asam Laktat

Pengujian pH
Pengujian asam dilakukan untuk melihat tingkat viabilitas bakteri asam laktat pada suasana asam yang bebeda, antara lain : pH 3,5 pH 5,5 pH 7,2 pH 9,5

Metode Penelitian
Alat
20 Tabung reaksi Rak Ose Bunsen Alkohol

Bahan
Media GYP miring Larutan pH (3,5 : 5,5 :7,2: 9,5) Isolat (y1, y2 ,y3 ,y4 ,y5)

Cara Kerja
Kultur BAL dari hasil pemurnian Diambil masingmasing kultur 1 ose

Diinkubasi pada suhu 30 C selama 24jam

Media GYP miring (pH 3,5 : 5,5 : 7,2: 9,5)

Diamati tingkat pertumbuhan bakteri

Hasil Pengamatan
Gambar 1. Pengamatan kultur BAL pada media GYP miring dengan pH 3,5

Gambar 2.Pengamatan kultur BAL pada media GYP miring dengan pH 5,5

Gambar 3. Pengamatan kultur BAL pada media GYP miring dengan pH 7,2

Gambar 4. Pengamatan kultur BAL pada media GYP miring dengan pH 9,5

Tabel Pertumbuhan BAL Pada Berbagai Variasi pH

pH ISOLAT 3,5 y1 y2 y3 y4 Cukup Cukup Cukup Baik 5,5 Cukup Cukup Cukup Cukup 7,2 Baik Baik Baik Cukup 9,5 Baik Baik Cukup Cukup

y5

Tidak Tumbuh

Jarang

Tidak Tumbuh

Jarang

Pembahasan
Pada isolat y1,y2,y3 ketika di kulturkan kedalam media dengan pH 3,5 menunjukkan ciri pertumbuhan cukup namun isolat y4 pertumbuhannya baik dan sedangkan pada isolat y5 tidak tumbuh Pada medium GYP miring dengan pH 5,5 semua isolat pertumbuhannya cukup namun pada isolat y5 pertumbuhannya jarang

lanjutan
Pada medium GYP dengan pH 7,2 menunjukkan pertumbuhan yang baik hanya pada y4 tingkat pertumbuhannya cukup dan y5 pertumbuhan jarang Sedangkan pada medium GYP agar dengan pH 9,5 isolat y1 dan y2 menunjukkan pertumbuhan baik, y3 dan y4 pertumbuhannya cukup dan isolat y5 tidak tumbuh

 Hal tersebut di dukung dengan teori bahwa Bakteri Asam Laktat memproduksi asam laktat yang dapat terakumulasi pada lingkungan di sekitarnya sehingga mengubah pH lingkungan 7-8 dapat menurunkan pH hingga 4,0-4,8. Hal ini menyebabkan mikroba patogen dan pembusuk yang umumnya hidup pada pH 6,08,0 tidak dapat tumbuh (Holzapfel et al., 1995).

Uji Suhu
Penguijian isolat dengan menggunakan variasi suhu untuk mengetahui suhu optimal bakteri asam laktat

Metode Penelitian
Alat
20 Tabung reaksi Rak Ose Bunsen Alkohol

Bahan
Media GYP miring Isolat (y1, y2 ,y3 ,y4 ,y5)

Cara Kerja
Kultur BAL dari hasil pemurnian Diambil masingmasing kultur 1 ose

Diinkubasi pada suhu 30 C selama 24jam

distreakkan Media GYP miring (pH 3,5 : 5,5 : 7,2: 9,5)

Diamati tingkat pertumbuhan bakteri

Hasil Pengamatan

Gambar 5 . Pertumbuhan BAL pada media GYP miring dengan suhu 4C

Gambar 6 . Pertumbuhan BAL pada media GYP miring dengan suhu 30C

Gambar 7. Pertumbuhan BAL pada media GYP miring dengan suhu 37C

Gambar 8 . Pertumbuhan BAL pada media GYP miring dengan suhu 47C

Tabel Pertumbuhan BAL pada Berbagai Variasi Suhu

SUHU ISOLAT 4 C y1 cukup 30 C Baik 37 C Baik 47 C Jarang

y2
y3 y4 y5

Baik
Baik Cukup Jarang

Baik
Baik Cukup Cukup

Baik
Cukup Baik Cukup

Cukup
Jarang Cukup Tidak Tumbuh

Tumbuh sangat baik = +++ Tumbuh baik = +++

Tumbuh cukup = ++ Tumbuh jarang = + Tidak tumbuh = -

Pembahasan
Pada isolat y1,y2,y3,y4,y5 pada suhu 4C menunjukkan pertumbuhan cukup Sedangkan pada suhu 30C (suhu kamar) dan juga suhu 37C semuwa isolat menunjukkan ciri pertumbuhan yang baik Dan pada suhu 47C semuwa isolat menunjukkan pertumbuhan jarang bahkan isolat y5 tidak tumbuh pada suhu tersebut

Lanjutan
Dari hasil pengamatana tersebut menunjukkan bahwa suhu optimal yang diperlukan untuk mendukung metabolisme bakteri asam laktat yaitu pada kisaran suhu 30-37C Menurut Supardi (1999) Kebanyakan bakteri dalam kultur laktat mempunyai suhu optimum 30C, tetapi beberapa kultur dapat membentuk asam dengan kecepatan yang sama pada suhu 37C maupun 30C.

Kesimpulan
BAL dari kultur youghurt memiliki pertumbuhan yang optimal pada kondisi asam pH 7. 2 -9.5 BAL dari kultur youghurt juga memiliki pertumbuhan optimal pada suhu 30 - 37C

Kesimpulan Penelitian
Sampel tergolong BAL = Y2 dan Y3 Y2= gram positif, bentuk coccus, rangkaian sel tetrad, bersifat katalase negatif Pediococcus. Y5= gram positif, bentuk coccus, katalase negatif, tidak mampu menghasilkan gas Streptococcus .

Y2

Pediococcus sp.

Y5

Streptococcus

TERIMA KASIH