POLYMERASE CHAIN REACTION ( PCR )

Suatu metode enzimatis Untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuens nukleotida tertentu secara

in vitro

P C R

Kary B. Mullis (1985) seorang peneliti dari Perusahaan CETUS Corporation

KOMPONEN UTAMA PCR

1. 2.
3. 4

Fragmen DNA yang akan digandakan

Oligonukleotida pendek u/ mengawali sintesis rantai DNA (forward dan reverse)

Enz. Yg mengkatalis reaksi sintesis DNA Deoksiribonukleotida trifosfat

Denaturasi (950C, 30)

Annealing (50-600C)

Extension (720C)

Denaturasi
Proses pemisahan untai ganda DNA

menjadi untai tunggal Dasar : adanya ikatan hidrogen antar basa komplementer (A-T :2; G-C:3) DNA harus terpisah sempurna, jika tidak??? Renaturasi DNA yang mengakibatkan kegagalan PCR

Annealing
Proses penempelan primer pada sekuens

DNA Suhu terbaik yang digunakan untuk Annealing adalah 50C dibawah Tm Tm : suhu dimana primer akan terdisosiasi dari utas cetakan DNA Tm (0C ) dihitung dengan rumus : 4(G+C) +2(A+T) Ex: CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC

Ketidaktepatan suhu annealing

Rendah

Melekat pada daerah tidak spesifik

Tidak melekat pada DNA

Tinggi

Extension
Proses pemanjangan untai DNA yang

dikatalis oleh enzim Taq Polymerase. Kecepatan kerja enzim tsb adalah 35-100 nukleotida per detik. Biasanya diakhir siklus PCR diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk PCR diharapkan berbentuk untai ganda

Faktor Keberhasilan PCR

Utama Lainnya

 dNTP

Konsentrasi yang digunakan untuk masing-masing dNTP harus sama. Primer Kriteria Primer yang baik : Berukuran 18-25 basa Mengandung 50-60% G+C DNA Untai DNA yang digunakan 105-106 molekul, dan merupakan DNA murni

 Enzim Taq Polymerase

Konsentrasi enzim yang terlalu tinggi menyebabkan penurunan kerja enzim Jumlah Siklus Siklus yang digunakan tergantung pada molekul DNA terget yang akan digandakan Siklus yang terlalu banyak akan meningkatkan konsentrasi produk tidak spesifik, sedangkan siklus yang terlalu sedikit akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan

 Teknis : Ruang PCR dipisahkan dengan ruang

manipulasi genetik yang lain Reagensia untuk PCR dipisahkan tersendiri untuk menghindari kontaminasi Tip dan sarung tangan digunakan single use.

Cek hasil PCR???

Aplikasi PCR (forensik)

STR (short tandem repeats) :
AAAAAAAAAAA would be referred to as (A)11 GTGTGTGTGTGT would be referred to as (GT)6 CTGCTGCTGCTG would be referred to as (CTG)4 ACTCACTCACTCACTC would be referred to as (ACTC)4