BIOKIMIA PENAMBATAN NITROGEN OLEH BAKTERI NON SIMBIOTIK Oleh : Nana Danapriatna Abstract

Some microbes in the group non-symbiotic bacteria capable of fix nitrogen. The process of nitrogen fixation by non-symbiotic bacteria requires several conditions : (1) the enzyme nitrogense, (2) the availability of energy resources in the form of ATP, (3) the potential lowering of the electron source, (4) a system of protection of nitrogenase enzyme from inactivation by oxygen, and (5) rapid transfer of nitrogen to prevent the inhibition of the enzyme nitrogenase. The result of nitrogen fixation by non-symbiotic aerobic bacteria was higher than the non-symbiotic fixation by anaerobic bacteria. The mechanism of protection of nitrogenase from oxygen by non-symbiotic aerobic bacteria are consuming excessive O2 for respiration and Azotobacter which have a capsule mucus (EPS) a thick helping protect the enzyme nitrogenase from O2. For anaerobic bacteria oxygen is not a problem because the environmental of bacteria are low oxygen Keyword : Nitrogen fixation, non-symbiotic bacteria, nitrogenase. I. PENDAHULUAN Nitrogen merupakan unsur hara tanaman esensial. Kecukupan suplai nitrogen pada tanaman dicirikan dengan kecepatan pertumbuhan tanaman dan warna daun hijau gelap. Ketidakseimbangan nitrogen atau terlalu besar unsur hara ini dibandingkan dengan unsur lain seperti P, K, dan S dapat mengakibatkan memanjangnya periode tumbuh dan tertundanya kematangan (Tisdale et al., 1985). Umumnya hara N tanah dalam kondisi kekurangan, hal ini memberikan kontribusi terhadap penurunan hasil. Di atmosfer nitrogen dalam bentuk molekul dan gas dinitrogen (N2) sangat berlimpah sekitar 80% dari total gas atmosfer, namun tidak dapat langsung digunakan untuk proses metaboilsme oleh tanaman tingkat tinggi atau binatang. Bentuk nitrogen yang dapat diambil oleh tanaman dari tanah adalah nitrat (NO3-) dan amonium (NH4+) (Barber, 1984; Tisdale et al., 1985). Kedua bentuk nitrogen tersebut sebagian besar berasal dari pupuk dan penambatan nitrogen udara oleh mikroba tanah. Berdasarkan data statistik FAOSTAT (2001), sekitar 43 juta ton pupuk N digunakan setiap tahun oleh seluruh negara untuk memproduksi tiga makanan pokok yaitu gandum, padi, dan jagung dengan rincian berturut-turut 17, 9, dan 16 juta ton pupuk N. Keadaan di Indonesia tidak berbeda jauh dalam penggunaan pupuk nitrogen terutama dalam bentuk urea. Menurut APPI (2010) setiap tahun kebutuhan pupuk urea bersubsidi untuk pertanian naik sebesar 6,11%. Kebutuhan pupuk urea bersubsidi pada tahun 2009 sebesar 6.407.045 t dan tahun 2010 diperkirakan menjadi 6.791.811 t. Sejalan dengan peningkatan kebutuhan pupuk terjadi pula peningkatan anggaran subsidi pupuk dari tahun ke tahun. Dalam lima tahun ke depan anggaran subsidi pupuk diperkirakan mencapai lebih dari Rp. 20 trilyun. Angka ini akan membebani

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

anggaran pemerintah. Oleh karena itu, anggaran subsidi pupuk diturunkan dari Rp. 17 trilyun menjadi sekitar Rp. 11 trilyun pada tahun 2010. Hal ini akan berakibat pada meningkatnya harga eceran tertinggi pupuk (Las et al., 2010). Efisiensi pupuk urea sangat rendah seringkali hanya 30 40 %, bahkan pada beberapa kasus lebih rendah lagi (De Datta, 1978; Choudhury dan Khanif, 2004). Selain itu, sebagian nitrogen dari pupuk urea yang diaplikasikan hilang melalui beberapa mekanisme termasuk volatilisasi amonia, denitrifikasi, dan pencucian, dan mengakibatkan munculnya masalah polusi terhadap lingkungan (De Datta dan Buresh, 1989; Mengel, 1990; Choudhury dan Kennedy, 2005). Volatilisasi amonia dan denitrifikasi menyebakan polusi udara melalui produksi gas rumah kaca seperti N2O dan N2. Pencucian nitrat (NO3-) akan menyebabkan pencemaran pada air tanah. Masalah tersebut menjadi perhatian utama bagi ahli lingkungan dan tanah diseluruh dunia. Selain itu, untuk memproduksi pupuk nitrogen memerlukan energi yang sangat besar dan tidak dapat terbarukan. Pemanfaatan teknologi penambatan nitrogen secara biologis (BNF) dapat menurunkan penggunaan urea sebagai sumber N, mencegah penurunan bahan organik tanah dan menggurangi polusi terhadap lingkungan pantas dipertimbangkan untuk dilakukan (Choudhury dan Kennedy, 2004; Kennedy et.al., 2004). Menurut Wu et.al. (1995) optimalisasi penambatan nitrogen udara secara biologis merupakan alternatif yang pantas dilakukan untuk mengurangi penggunaan pupuk N. Jumlah nitrogen hasil penambatan nitrogen secara biologis merupakan yang terbesar dari seluruh proses penambatan N2 atmosfer menjadi ion amonium. Hal tersebut memperlihatkan bahwa penambatan nitrogen secara biologis merupakan poin kunci masuknya molekul nitrogen kedalam siklus biogeokimia nitrogen (Gambar 1.)

Gambar 1. Siklus nitrogen di alam (Taiz dan Zeiger, 2002) Sejumlah mikroorganisme tanah dan air sanggup mengunakan secara langsung nitrogen atmosfer sebagai sumber nitrogen bagi kehidupanya. Kelompok mikroorganisme ini ada dua menurut cara penambatan nitrogen yang dilakukan yaitu : (1) Penambat nitrogen nonsimbiosis yaitu mikroorganisme yang sanggup mengubah molekul nitrogen menjadi amonium tanpa

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

bergantung pada organisme lain; (2) Penambat nitrogen simbiosis yaitu mikroorganisme yang menambat nitrogen melalui hidup bersama dalam akar leguminosa dan tumbuhan lain Berbagai jenis bakteri penambat nitrogen atmosfer secara biologis yang dapat mengubah N2 menjadi amonium (Tabel 1), antara lain terdiri atas rhizobia, sianobakter (ganggang hijau biru), bakteri foto-autotrofik pada air tergenang dan permukaan tanah, dan bakteri heterotrofik dalam tanah dan zona akar (Ladha dan Reddy, 1995, Boddey et al. 1995, Kyuma, 2004). Bakteri tersebut mampu mengikat nitrogen dari udara, baik secara simbiosis (root-nodulating bacteria) maupun nonsimbiosis (free-living nitrogen-fixing rhizobacteria). Tabel 1. Beberapa organisme yang dapat menambat nitrogen atmosfer

Sumber : Taiz dan Zeiger, 2002 Untuk terjadinya proses penambatan nitrogen menurut Hamdi (1982) dibutuhkan beberapa syarat yaitu : (1) adanya enzim nitrogense; (2) ketersediaan sumber energi dalam bentuk ATP; (3) adanya sumber penurun potensial dari elektron; (4) adanya sistem perlindungan enzim nitrogenase dari inaktivasi oleh oksigen; dan (5) pemindahan yang cepat nitrogen hasil tambatan dari tempat penambatan nitrogen untuk mencegah terhambatanya enzim nitrogenase. Uraian selanjutnya akan ditekankan pada proses biokimia penambatan nitrogen secara non simbiois baik yang aerobik maupun anaerobik.

II. MEKANISME BIOKIMIA DARI PROSES PENAMBATAN N2

Penambatan nitrogen secara biologis dan secara kimiawi mengubah gas dinitrogen (N2) menjadi amonia dengan katalis enzim nitrogenase (Saika dan Jain, 2007). Reaksi yang dikatalisasi oleh enzim nitrogenase digambarkan pada Gambar 2.

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

Gambar 2. Perubahan Nitrogen Secara Biologis dan Kimiawi Enzim yang berperan penting dalam penambatan nitrogen adalah nitrogenase yang terdapat dalam sel bakteri penambat nitrogen. Nitrogenase disusun oleh dua komponen yang saling menunjang yaitu protein Fe (komponen I) dan protein Mo-Fe (komponen II) (Hamdi, 1982). Protein Fe berukuran lebih kecil dari komponen II dan mempunyai dua sub-unit serupa berukuran masing-masing 30 sampai dengan 72 kDa, tergantung pada organisma. Setiap subunit berisi satu kluster besi-belerang (4 Fe dan 4 S2) yang turut ambil bagian dalam reaksi redox terlibat dalam konversi N2 menjadi NH3. Protein MoFe mempunyai empat sub-unit, dengan masa total satu molekul sekitar 180 sampai dengan 235 kDa, tergantung pada spesies organisme. Setiap subunit mempunyai dua kluster MoFeS (Taiz dan Zeiger, 2002). Protein Fe adalah menjadi tidak aktif oleh O2 dengan waktu paruh kerusakan dari 30 sampai dengan 45 detik. Protein MoFe juga menjadi tidak aktif oleh oksigen, dengan satu waktu paruh 10 menit. (Dixon dan Wheeler 1986). Diduga 2 molekul protein Fe akan bersenyawa dengan 1 molekul protein Mo-Fe untuk membentuk nitrogenase aktif di dalam sel sel bakteroid atau sel-sel Azotobacter (Hamdi, 1982). Gambaran terperinci dari pengikatan ATP, pengangkutan elektron dan pengikatan substrat di antara kompenan-kompenan nitrogenase secara sederhana dapat dilihat pada Gambar 3. Senyawa protein Fe dari nitrogenase menerima elektron-elektron berpotensial rendah dari Ferredoxin dan Flavodoxin, kemudian protein Fe bergabung dengan ATP menghasilkan suatu senyawa FeMgATP yang potensial oksidasinya rendah. Hanya satu molekul MoMgATP hasil reduksi yang dapat berlaku sebagai pereduksi protein Mo-Fe . Terbukti bahwa Mo-Fe yang berperan dalam penambatan N2 (Siegbahn et. al., 1998).

Gambar 3. Reaksi penambatan nitrogen (Taiz dan Zeiger, 2002)

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

Proses fiksasi N2 dengan adanya enzim nitrogenase terjadi sebagai berikut: (1) energi ATP dan elektron feredoksin mereduksi protein Fe menjadi reduktan, (2) reduktan itu mereduksi protein MoFe yang kemudian mereduksi N2 menjadi NH3 dengan hasil sampingan berupa gas H2, dan (3) bersamaan dengan itu terjadi reduksi asetilen menjadi etilen yang dapat digunakan sebagai indikator proses fiksasi N2 secara biologis (Marschner, 1986; Buchanan et. al., 2000). MoFe protein dapat mereduksi beberapa substrat seperti asetilen, sianida dan azida (Tabel 2.), namun demikian dalam kondisi normal reaksi hanya terjadi antara N2 dan H+ yang dikatalisasi oleh enzim nitrogenase. Kemampuan ini dapat digunakan untuk mengukur kemampuan organisme dalam enambat nitroge menggunakan proses reduksi asetilen (ARA). Tabel 2. Reaksi yang Dikatalisis oleh Enzim Nitrogenase (Taiz dan Zeiger, 2002) N2 NH3 N2O N2 + H2O N3- N2 NH3 C2H2 C2H4 2H+ H2 ATP ADP + Pi Reaksi yang dikatalis oleh nitrogenase Penambatan molekul nitrogen Reduksi nitrous oksida Reduksi Azide Reduksi asetilen Produski H2 Aktivitas hidrolisa ATP

Gambar 4. Diagram proses Reduksi N2 menjadi NH4+ (Patki, 2006)

Dalam fiksasi nitrogen diperlukan energi dalam bentuk ATP dan elektron berpotensial rendah secara terus menerus (Saika dan Jain, 2007). Hidrogen yang berasal dari karbohidrat

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

maupun hasil reduksi nitrogase dipindahkan oleh enzim hidrogenase ke NAD, sehingga terbentuk NADPH2. dalam perjalannya dari NADP2 ke nitrogenase, elektron akan melalui pembawa-pembawa elektron eperti Feredoxin dan flavodoxsin. Selama perjalan tersebut terjadi penurunan potensial dari elektron seperti Feredoxin dan flovodoksin, sehingga diperoleh elektron berpotensial rendah yang siap digunakan oleh nitrogenase . ATP disuplai oleh suatu sistem penghasil ATP seperti acetokinase dan acetylphosohate atau phosphocreatine kinase dan creatin phosphate. ATP dihidrolisis menjadi ADP dan fosfat organik dalam reaksi nitrogenase jika ATP prekoursor habis dan ratio ATP/ADP mencapai nilai 0.5 kemudian terjadi penggunaan ATP oleh nitrogenase, maka mulai saat itu aktivitas nitrogenase benar-benar terhambat (Dalton dan Mortenson, 1972). Dalam memproduksi 2 NH3 dan H2 dibutuhkan setara 8 pereduksi dalam reaksi penambatan nitrogen atmosfer. Selain itu, transfer dari setiap elektron ke inti Mo-Fe memerlukan satu siklus dissosiasi ikatan oleh sub unit reduktase, dengan hidrolisis 2 molekul ATP setiap siklus. Secara keseluruhan proses reduksi molekul N2 memerlukan hidrolisis 16 molekul ATP, dan 8 siklus dissosiasi reductase dari nitrogenase. (Berg et. al., 2002 dalam Patki, 2006). Gambaran selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 4. Untuk setiap organisme pembentukan ATP dapat berbeda-beda kemampuannya. Dengan demikian akan mengakibatkan perbedaan dalam jumlah hasil tambatan nitrogen atmosfernya akibat berbedanya jenis mikroba penambat nitrogen. ATP sebagai representasi dari energi dihasilkan oleh mikroorganisme melalui proses perombakan bahan organik secara aerob (respirasi) dan anaerob (fermentasi) sesuai dengan jenis mikroorganismenya. Hasil energi dari mikroorganisme aerobik lebih banyak jumlah ATP yang dihasilkannya dari pada mikroorganisme anaerob Sebagai gambaran hasil oksidasi gluokosa oleh bakteri aerob sebanyak 32 ATP per glukosa dan bakteri anaeroba menghasilkan 2 ATP per glukosa (Koolman dan Roehm, 2005). Skema selengkapnya dapat dilihat pada Gambar 5. Nucleotida piridin yang tereduksi terbentuk dengan oksidasi asam organik dalam siklus TCA, digunakan untuk membentuk ATP melalui phosphorilasi oksidatif. Ackrell dan jones (1971) melaporkan adanya tiga tempat phosphorilasi dalam membran respirasi dari sel-sel Azotobacter vinelandii. Efisiensi phosphorilasi khususnya pada tempat pertama sangat rendah pada kosentrasi oksigen yang tinggi, tetapi meningkat bila kosentrasi oksigen menjadi kecil. Efisiensi yang rendah dari energi gabungan pada konsentrasi oksigen yang tinggi, dapat diharapkan untuk membuat pengurangan ratio ATP/ADP Pi yang besar dan kemudian menyebabkan hilangnya kontrol respirasi di seluruh sel organisme yag diikubsi pada tekanan O2 yang tinggi. Proes respirasi didalam sel tersebut berkaitan dengan fungsi pembentukan ATP dan melindungi nitrogenase dari pengaruh hambatan oleh oksigen.

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

Enzim nitrogenase menjadi tidak aktif jika tekanan oksigen tinggi, oleh karena itu beberapa bakteri non simbiotik melakukan proteksi enzim nitrogenase terhadap oksigen dengan berbagai cara tergantung jenis mikrobanya. Pada bakteri non simbiotik an aerob, oksigen tidak menjadi masalah karena

Gambar 5. Skema Oksidasi Glukosa secara aerob dan anaerob (Koolman dan Roehm, 2005)

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

Lingkungan hidup bakteri tersebut pada daerah yang rendah kadar oksigennya. Pada bakteri nonsimbiotik aerob oksigen menjadi masalah karena untuk hidup bakteri tersebu membutuhan oksigen yang banyak, akan tetapi enzim nitrogenase menjadi tidak aktif jika ada oksigen. Perlindungan enzim terhadap oksigen dengan cara mengkonsumsi O2 secara

berlebihan untuk respirasi dan Azotobacter yang mempunyai kapsul lendir yang tebal membantu melindungi enzim nitrogenase dari O2 (Gambar 6).

Gambar 6. Mekanisme proteksi enzim nitrgenase dari oksegen pada Azotobacter vinelandii III. PENUTUP Nitrogen hasil proses penambatan nitrogen secara biologis oleh mikroorganisme merupakan poin kunci masuknya molekul nitrogen kedalm sikus nitrogen dialam. Sejumlah mikroorganisme tanah dan air sanggup menambat nitrogen atmosfer menjadi amonium. Kelompok mikroorganisme ini ada dua menurut cara penambatan nitrogen yang dilakukan yaitu : (1) Penambat nitrogen nonsimbiotis; (2) Penambat nitrogen simbiosis. Kelompok non simbiosis terbagi dua yaitu organisme aerob dan anaerob. Untuk terjadinya proses penambatan nitrogen dibutuhkan beberapa syarat yaitu : (1) adanya enzim nitrogense; (2) ketersediaan sumber energi dalam bentuk ATP; (3) adanya sumber penurun potensial dari elektron; (4) adanya sistem perlindungan enzim nitrogenase dari inaktivasi oleh oksigen; dan (5) pemindahan yang cepat nitrogen hasil tambatan dari tempat penambatan nitrogen untuk mencegah terhambatanya enzim nitrogenase. Hasil tambatan nitrogen oleh bakteri nonsimbiosis aerob lebih tinggi dibandingkan hasil tambatan oleh bakteri nonsimbiosis anaerob. Hal ini berkaitan dengan jumlah energi dalam

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

bentuk ATP yang dihasilkan bakteri aerob lebih banyak dari pada bakteri anaerob. Bakteri aerob membutuhkan mekanisme perlindungan enzim nitrogenase terhadap oksigen yang dapat menginaktifkan enzim tersebut. Mekanisme perlindungan tersebut adalah mengkonsumsi O2 secara berlebihan untuk respirasi dan Azotobacter yang mempunyai kapsul lendir (EPS) yang tebal membantu melindungi enzim nitrogenase dari O2. Untuk bakteri anaerob oksigen tidak menjadi masalah karena lingkungan bakteri tersebut rendah kadar oksigennya. DAFTAR PUSTAKA Acrell , B.A.C and C.W. Jones. 1971. The respiratory system of Azotobacter vinelandii. 1. Properties of phosphorilating respiratory membrane. Eur. J. Biochem. 20 : 22 28. APPI. 2010. Kebutuhan pupuk urea 2006 http://www.appi.or.id/images/statistic/KEBUTUHAN_PUPUK_UREA_2006__2015.xls. Diunduh tanggal 15 April 2010. 2015.

Barber, S.A. 1984. Soil Nutrient Bioavailability. A Mechanistic Approach. A Wiley-Interscience Publication. John Wiley & Sons. New York. Boddey, R.M., de O.C. Oliviera, S. Urquiaga, V.M. Reis, F.L. Olivares, V.L.D. Baldani, and J. Dobereiner. 1995. Biological nitrogen fixation associated with sugar cane and rice: contributions and prospects for improvement. Plant Soil 174:195-209. Buchanan, B., Gruissem, W., and Jones, R. 2000 Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists. Rockville, MD. Choudhury A.T.M.A. and Kennedy I.R. 2004. Prospects and potentials for systems of biological nitrogen fixation in sustainable rice production. Biol. Fertil. Soils 39 : 219227. Choudhury A.T.M.A. and Kennedy I.R. 2005. Nitrogen fertiliser losses from rice soils and control of environmental pollution problems. Communications in Soil Science and Plant Analysis 36 : 16251639. Choudhury A.T.M.A. and Khanif Y.M. 2004. Effects of nitrogen and copper fertilization on rice yield and fertiliser nitrogen efficiency: A 15N tracer study. Pakistan Journal of Scientific and Industrial Research 47 : 5055. Dalton, H. and L.E. Mortenson.1972. Dinitrogen (N2) fiation (with a biochemical emphasis). Bacteriol. Rev.36 : 231 260. De Datta S.K. 1978. Fertilizer management for efficient use in wetland rice soils. Pp. 671701 in Soils and rice, ed. by F.N. Ponnamperuma. International Rice Research Institute: Los Baos, the Philippines. De Datta S.K. and Buresh R.J. 1989. Integrated nitrogen management in irrigated rice. Advances in Soil Science 10 : 143169. Dixon, R. O. D., and C. T. Wheeler. 1986 Nitrogen Fixation in Plants. Chapman and Hall, New York. FAOSTAT. 2001. Agricultural Data. Food and Agricultural Organization of the United Nations, Rome. Hamdi, Y.A. 1982. Application of Nitrogen-Fixing System in Soil Improvement and Management. FAO Soil Bulletin 49. FAO Rome.

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

Kennedy I.R., Choudhury A.T.M.A. and Kecsks M.L. 2004. Non-symbiotic bacterial diazotrophs in cropfarming systems: can their potential for plant growth promotion be better exploited. Soil Biology and Biochemistry 36 : 12291244. Koolman, J. and K.H. Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry. 2nd edition. Thieme Verlag Rdigerstrasse. Stuttgart, Germany. Kyuma, Kazutake. 2004. Paddy soil science. Kyoto Univ. Press and Trans Pacific Press. Kyoto. Las, I., S. Rochayati, D. Setyorini, A. Mulyani dan D. Subardja. 2010. Peta Potensi Penghematan Pupuk Anorganik dan Pengembangan Pupuk Organik pada Lahan Sawah di Indonesia. Badan penelitian dan Pengembangan Pertanian. Kementrian Pertanian. Jakarta.

Ladha, J.K. and P.M. Reddy. 1995. Extension of nitrogen fixation to rice: necessity and possibilities. GeoJournal. 35:363-372. Marschner, H. 1986. Mineral Nutrion of Higher Plants. Academic Press. Harcourt Brace Jovanovich Publishers. London. Mengel, K. 1990. Impact of Intensive Plant Nutrient Management on Crop Production and Environment. 14th Ing. Long. of Soil Sci. Plenary Lecture : 42-52. Pakti, A. 2006. Background: The Biochemistry of Nitrogen Fixation. http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462bh2008/462bhonorsprojects/462b honors2006/patkia/nfixation.htm. Diunduh tanggal : 1 Mei 2009.

Saika, S.P. and V. Jain. 2007. Biological nitrogen fixation with non-legumes : An achievable target or dogma ? Current Sci. 92 (3) : 317 322. Siegbahn, P.E.M., J. Westerberg, M. Svenson and R.H. Crabtree. 1998. Nitrogen faixation by nitrogenase : A quantum chemical study. J.Phys.Chem.B. 102 : 1615 1623. Taiz, L. and E. Zeiger. 2002. Plant physiology. 3rd ed. Sinauer Associates. Tisdale, S.L., W.L. Nelson, and J.D. Beaton. 1985. Soil Fertility and Fertilizers. 4 th ed. MacMillan Publishing Company. New York. Wu, P., Zhang, G., Ladha, J.K., McCouch, S.R., Huang, N., 1995. Molecular-marker-facilitated investigation on the ability to stimulate N2 fixation in the rhizosphere by irrigated rice plants. Theoret. Appl. Genet. 91, 11711183.

CEFARS : Jurnal Agribisnis dan Pengembangan Wilayah Vol. 1 No. 2, Juli 2010

10