ENZIM dan KOENZIM-2

FAKTOR YANG MEMPENGARUHI REAKSI ENZIMATIS 1. 2. 3. 4. Pengaruh Pengaruh Pengaruh Pengaruh Kadar Enzim dan Substrat suhu pH Inhibitor

I NYOMAN SUARSANA

LOGO

LABORATORIUM BIOKIMIA FAKULTAS KEDOKERAN HEWAN

1

Company Logo

1. Pengaruh Kadar Enzim dan Substrat

Jumlah substrat [S] yang ditransformasi

3x 2x

Peningkatan konsentrasi Enzim [E]

Kecepatan reaksi bergantung pada konsentrasi enzim yg berperan sebagai katalisator Pada Gambar terlihat, banyaknya substrat ditransformasikan sesuai dengan tingginya konsentrasi enzim yang digunakan

4x

Jika [E] tetap, sedangkan [S] dinaikan maka hubungan yang didapat seperti pada Gambar disamping Pada Gambar terlihat pada penambahan pertama V reaksi naik dengan cepat, tapi jika penambahan [S] dilanjutkan, V mulai menurun sampai pada suatu ketika tidak ada tambahan V reaksi
4
Company Logo

1x

Waktu reaksi Gambar hubungan antara [E] dengan Company Logo 3 V apabila [S] berlebihan

2. Pengaruh Suhu
Reaksi yang dikatalis oleh enzim peka terhadap suhu. Enzim sebagai protein akan mengalami denaturasi jika suhu dinaikan, akibatnya daya kerja enzim menurun suhu optimum reaksi tubuh 37C
5
Company Logo

KECEPATAN REAKSI

SUHU

Company Logo

3. Pengaruh pH
Sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah dipengaruhi pH, shg berpengaruh terhadap aktivitas enzim Perubahan pH menyebabkan denaturasi enzim dan mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim
7
Company Logo

Company Logo

Chymotrypsin Is Activated by Proteolysis

Chymotrypsinogen (inactive)

pH Influences Chymotrypsin Activity

Relative Activity

245 -Chymotrypsin (active) R15-I16 Trypsin

Adapted from Campbell (1999) Biochemistry (3d) p.179

-Chymotrypsin S14-R15 L13 I16 Y146 T147-N148 A149 Disulfide bonds

9
Company Logo

10

11

-Chymotrypsinogen (active)

pH
Company Logo p.162 10 Adapted from Dressler & Potter (1991) Discovering Enzymes,

Buffer pH

Imidazole on Histidine Is Affected by pH

pH 6 HN C H C NH C H
H O CO =
Juang RH (2004) BCbasics

pH Influences Net Charge of Protein

10 9 8 7
Isoelectric point, pI

pH 7 N C H

H+

HN C

6 5 4 3

HN

Inactive + NH HOCH2

Asp 102

C C-H CH2 His 57

Ser 195

Company Logo

Net Charge of a Protein 11

Company Logo 12 Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.158

Adapted from Dressler & Potter (2000) Discovering Enzymes, p.163

4. Pengaruh Inhibitor
Apabila aktivitas menjadi terhambat oleh senyawa atau gugus senyawa tersebut, maka senyawa ini disebut INHIBITOR Tidak semua inhibitor merugikan. Dalam sel juga ada inhibitor yg berfungsi sebagai regulasi reaksi enzim Inhibitor enzim dapat dibagi 3 macam, yaitu: 1. Inhibitor kompetitif 2. Inhibitor non-kompetitif 3. Inhibitor uncompetitive
13
Company Logo

1. Inhibitor kompetitif
1. Inhibitor berkompetisi dengan substrat memperebutkan tempat aktif pada enzim yang bebas 2. Selanjutnya inhibitor tersebut membentuk kompleks enzim-inhibitor [EI], sehingga tidak dapat terbentuk kompleks [ES] dan tidak menghasilkan produk yg diharapkan 3. Pada keadaan kompetitif terdapat 2 kemungkinan kompleks yang terjadi, yaitu [ES] dan [EI]. Disatu pihak aktif dan dilain pihak tidak aktif 4. Laju reaksi bergantung pada [ES] dan pembentukan [EI] akan mengurangi laju reaksi
14
Company Logo

Competitive Inhibition
5. konsentrasi ES, EI bergantung pada beberapa faktor: a. konsentrasi substrat, b. konsentrasi inhibitor, c. afinitas enzim terhadap S dan I Pada inhibitor kompetitif dapat disimpulkan sbb: 1. Tingkat hambatan menurun dengan meningkatnya [S] pada [I] tetap. 2. Km yang didapatkan (Km apparent) lebih besar daripada Km yang sebenarnya 3. Tidak mempengaruhi nilai V maks 4. Tidak menghalangi penguraian kompleks enzimsubstrat
15
Company Logo

Competitive
v=
5

S
K m + [S]
Vmax [S]

CI

Vmax [S] Km + [S]

No I

v=

EI Kic E S+E ES E+P + I 1 1 1 Km 1 1 K m 1 = + = + v Vmax [S] Vmax v Vmax [S] Vmax

2.5

4 0.5Vmax v, mol/min mol/min v, 3 +CI 0.5V max Km

= 1 +

1/v, /mol/min /mol/min 1/v,

[I] Kic

+CI 2

Kmapp/Vmax

1.5 K / Vmax Kmm /Vmax

1/Vmax 1/V max

Kmapp
1
Km

No I

-1/Km

app

-1/K Km -1/ m

0.5

0 0 10 20 30 [S], mM 40 50
-0.6 -0.4 -0.2

0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1/[S], /mM 1

16

Company Logo

Competitive Inhibition
Product Tanpa inhibitor Vmaks C-OOC-H V + inhibitor kompetisi C-H C-OOSubstrate Succinate C-OOH-C-H H-C-H C-OOCompetitive Inhibitor Glutarate C-OOH-C-H H-C-H H-C-H C-OOMalonate C-OOH-C-H C-OOOxalate C-OOC-OO-

[S] Hubungan antara V dan [S] dengan atau tanpa inhibitor

17
Company Logo

Km

Succinate Dehydrogenase
Company Logo 18 (1995) Principles of Cell and Molecular Adapted from Kleinsmith & Kish Biology (2e) p.49

Sulfa Drug Is Competitive Inhibitor

Domagk (1939)

Enzyme Inhibitors Are Extensively Used

Sulfa drug (anti-inflammation)

Pseudo substrate competitive inhibitor
Bacteria needs PABA for the biosynthesis of folic acid

Para-aminobenzoic acid (PABA)

H2NPrecursor

-COOH

Protease inhibitor

Alzheimer's disease

Folic acid

Tetrahydrofolic acid

Plaques in brain contains protein inhibitor

HIV protease is critical to life cycle of HIV

HIV protease (homodimer): homodimer):
subunit 1 subunit 2

H2N-

-SONH2

Sulfa drugs has similar structure with PABA, and inhibit bacteria growth.

inhibitor is used to treat AIDS Asp

Asp

Symmetry Not symmetry

Sulfanilamide Sulfa drug (anti-inflammation)

Company Logo 19 Adapted from Bohinski (1987) Modern Concepts in Biochemistry (5e) p.197

Human aspartyl protease:

(monodimer)
20

domain 1 domain 2

Asp

Asp

Company Logo Juang RH (2004) BCbasics

HIV protease vs Aspartyl protease

HIV Protease inhibitor is used in treating AIDS 2. Inhibitor non-kompetitif
1. inhibitor kompetitif adalah hambatan di mana inhibitor bereaksi dengan suatu tempat diluar tempat aktif, sehingga kombinasi substrat dengan enzim tidak dihalangi tetapi pemecahan kompleks ES dicegah. 2. tingkatan inhibisi tidak akan bergantung pada [S] atau Ks (konstanta disosiasi substrat) tetapi pada [I] dan Ki (konstanta disosiasi inhibitor) 3. pada hambatan non-kompetitif, inhibitor dapat berikatan baik pada enzim bebas maupun kompleks ES
Company Logo Juang RH (2004) BCbasics

HIV protease (homodimer) subunit 1

Asp

subunit 2
Asp

Symmetric dimer

domain 1
Asp

domain 2
Asp

Asymmetric monomer

Aspartyl protease (monomer)

21

22

Company Logo

Noncompetitive Inhibition
4. inhibitor kompetitif ini tidak dapat dihilangkan dengan penambahan substrat. Inhibitor berikatan dengan permukaan enzim tanpa lepas lagi dan tempatnya tidak dapat pula diganti oleh substrat 5. nilai Km tidak berubah oleh inhibitor
v, mol/min

Noncompetitive (mixed-type)
v=
5 5

Vmax [S] Vmax [S] v= Km + [S] K m + ' [S]

No I

EI Kic NCI S + E + I 1 1 Km 1 = + v Vmax [S] Vmax

2.5 2 1/v, /mol/min /mol/min 1/v,

ESI Kiu ES E+P + I 1 K m 1 ' = + v Vmax [S] Vmax

4 4

0.5Vmax

3 3

0.5V + NCImax

0.5Vmax

[I] = 1 + Kic

1/Vmaxapp Km/Vmaxapp
+ NC I Km /Vmax K /V m max 1/V max 1/Vmax

2 2 Km

' = 1 +

[I] Kiu
-1/K Km -1/ m

1.5

No I

1 1

Km

0.5

0 0 0 0 10 10 20 20 30 30 [S], [S], mM mM 40 40 50 50 -0.6 -0.4 -0.2

0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1/[S], /mM 1

23

Company Logo

24

Company Logo

Uncompetitive Inhibition
3. Inhibitor uncompetitive
1. pada inhibitor uncompetitive, inhibitor hanya dapat bereaksi setelah terjadi kompleks ES. 2. inhibitor tidak menghalangi pembentukan kompleks ES, tetapi menghalangi reaksi selanjutnya, jadi menghalangi pembentukan produk. ES + I ES Uncompetitive (catalytic)
v=
5 No I 4 v, mol/min 2

Vmax [S] Km + [S]

v=

Vmax [S] Km + ' [S]

ESI Kiu UCI S + E ES E+P + I 1 K 1 1 1 Km 1 ' = + = m + v Vmax [S] Vmax v Vmax [S] Vmax
2.5

+ UC I 0.5V max

0.5Vmax

1/v, /mol/min

0.5Vmax

1/Vmaxapp Kmapp/Vmaxapp
1/V max K /V m max + UC I Km/Vmax No I

Kmapp
Km Km

' = 1 +

[I] Kiu
-1/Km -1/Km

1.5

-1/Kmapp
40 50

0.5

1/V max 0 20 30 [S], mM [S]. -0.6 -0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1/[S]. /mM 1/[S], 1

0 0 10

25

Company Logo

26

Company Logo

Enzyme Inhibition Summary

v=
5

Vmax [S] Vmax [S] v= Km + [S] K m + ' [S]

No inhibitor +CI

1 1 Km 1 = + v Vmax [S] Vmax

1 K m 1 ' = + v Vmax [S] Vmax

K app/V m max +CI

4 v, mol/min

= 1 +

[I] Kic [I] Kiu

1/v, /mol/min -1/Km -1/Km -1/Km

2.5

app 2 Km/Vmax 1.5 1/Vmax 1 app 1/Vmaxapp

+ UC I + NC I

' = 1 +

0.5V max app app

Kmapp /Vmaxapp + NC I + UC I No I

Kapp Km Km

app m 0.5Vmax

0.5Vmax

-1/K app m

0.5 K /V 1/Vmax m max 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1/[S], /mM 1

0 0 10 20 30 [S], mM 40 50 -0.6 -0.4 -0.2

27

Company Logo

28

Company Logo

REGULASI AKTIVITAS ENZIM

Berbagai reaksi enzimatis tidaklah berjalan secara mekanis begitu saja, tanpa ada pengendalian Reaksi enzimatis berjalan secara sangat terkoordinasi satu sama lain Pengendalian reaksi enzimatis berlangsung pada berbagai tingkat di dalam sel, semenjak dari gen sampai molekul enzim itu sendiri. Regulasi aktivitas enzim dilakukan oleh: 1. Pengendalian pada tingkat Gen 2. Pengendalian ditingkat molekul enzim oleh produk 3. Pengendalian enzim melalui perubahan struktur molekul
29
Company Logo

1. Pengendalian pada tingkat gen Sebagai protein, informasi genetik enzim terekam dalam gen Sel hanya akan mensintesis suatu enzim, jika sel mengandung gen yang menyandikan enzim yang dimaksud
Contoh, manusia tidak bisa mensintesis vitamin C kerena tidak mempunyai gen yang menyandikan enzim untuk mensintesis vitamin C Pertanyaanya adalah apakah semua enzim yang informasi genetiknya terkandung dalam genom sel, akan disintesis oleh sel tersebut setiap saat?
Company Logo

30

Terdapat 2 mekanisme pengaturan secara genetik 1. Inducible enzyme (enzim terbangkitkan) 2. Represi enzyme (pembungkaman enzim) 3. Enzim konstitutif Inducible enzyme: jika sel memerlukan enzim dalam keadaan tertentu untuk metabolisme, maka sel akan membuat enzim tersebut. Ini artinya, enzim tersebut dalam keadaan normal tidak ada, baru dibuat setelah diperlukan oleh sel
31
Company Logo

Represi enzyme: dalam keadaan tidak memerlukan enzim tersebut, gen untuk enzim tersebut mengalami pembungkaman atau represi. Ini artinya, dalam keadaan normal enzim tersebut ada tetapi jika tidak diperlukan maka gen akan menghentikan pembentukan enzim tersebut. Selain itu, ada enzim konstitutif yang terus menerus disintesis semua sel selama daur hidupnya, ada juga gen untuk enzim dan protein yang mengalami pembungkaman permanen atau terus menerus mulai dari tahap perkembangan sel tertentu.
32
Company Logo

Pengendalian pada tingkat gem

Transcription DNA
ribosome mRNA proteins RNA Processing RNA Transport RNA Degradation

DNA
5 process mRNA 3 mature mRNA 3 tail proteins

Translation Activity Proteolysis

cap 5

Prokaryotics

Post-translational control
33

Eukaryotics
Company Logo Juang RH (2004) BCbasics

34

Company Logo

Figure 6a. Derepression of the trp operon. In the absence of trp the inactive repressor cannot bind to the operator to block transcription.The cell must synthesize the amino acid.
35

Figure 6b. Repression of the trp operon. In the presence of tryptophan the trp operon is repressed because trp activates the repressor. Transcription of is blocked because the active repressor binds to the DNA and prevents binding of RNA polymerase.
36
Company Logo

Company Logo

Ekspresi Operon di Regulasi oleh Metabolitnya

S S
R
Operator

S
R

Metabolit hulu (Upstream) menginaktifkan repressor, dan memicu eksresi gen

Gene mRNA

RNA Polymerase

ON

P
R
Operator Figure 8. Enzyme Induction. Induction (or derepression) of the lac operon

P
R

Metabolit hilir (Downstream) Berikatan dan mengaktifkan represor Kemudian mematikan ekspresi gen

Gene

RNA Polymerase
38

OFF
Company Logo Juang RH (2004) BCbasics

37

Company Logo

2. Pengendalian ditingkat molekul enzim oleh produk

SENYAWA PREKURSOR Pengendalian dilakukan melalui Alosterik kontrol atau feedback inhibition. Regulasi alosterik mengatur aktivitas enzim melalui hasil akhir (end product). Pada sistem ini End product akan menghambat pembentukan enzim pertama (ezim alosterik) yang mengawali jalur reaksi tersebut bilamana hasil akhir melebihi kebetuhan sel
39

EN-1 METABOLIT-1 EN-2 METABOLIT-2 EN-3 METABOLIT-3 EN-4 PRUDUK AKHIR

Company Logo

Alosterik kontrol atau Feedback control dibedakan atas :

1. 2. 3. 4. Simple feedback Concerted feedback Multiple enzim feedback Commulative feedback

40

Company Logo

10

Figure 3. Jalur biosintesis tryptophan pada E. coli. Jalur ini diregulasi oleh proses feedback inhibition. Tryptophan (trp), sebagai end product pada jalur ini, merupakan molekul effector yang mengikat tempat aktif enzim allosteric, yang merupakan enzim pertama yang mengawali jalur ini. Ketika trp mengikat tempat aktif (katalitik) enzyme, maka enzyme tidak mampu bereaksi dengan subtrates dan menghambat sintesis anthranilate.Company Logo 41

Figure 4. Skema umum regulasi jalur metabolisme bercabang oleh proses feedback inhibition.
42
Company Logo

Regulation of Enzyme Activity

Inhibitor
or

Proteolysis

o
1. 2. 3. 4. Simple feedback Concerted feedback Multiple enzim feedback Commulative feedback

x
I
I

proteolysis

inhibitor

Feedback regulation
1 2
S

Phosophorylation

R regulator effector

x
R

P
S

o
(+) P

phosphorylation
Juang RH (2004) BCbasics

Signal transduction

x
(-)
3 4
43
Company Logo

A or
Regulatory subunit
S

o
44

cAMP or calmodulin
Company Logo

11

Cascade Amplification of Signals

3. Pengendalian enzim melalui perubahan struktur molekul

Seringkali juga keadaan memerlukan sel untuk mengolah substrat dalam waktu yang singkat, melalui jalur metabolisme yang tidak selalu aktif. Untuk memenuhi kebutuhan seperti ini, enzim tertentu dibuat tidak aktif. Baru jika keadaan memerlukan enzim seperti ini diaktifkan melalui perubahan kimia yang ringkas, stabil namun cepat. Pengaktifan ini melalui perubahan struktur atau perubahan kovalen molekul enzim. Peristiwa ini sering dinamai modifikasi kovalen Modifikasi kovalen: searah (jika sudah aktif tidak bisa diinaktifkan), berbalik (tidak aktif aktif)

Cascade

nS
45

1 Enzyme

nP
46
Company Logo

Company Logo Juang RH (2004) BCbasics

KOFAKTOR: KOENZIM, APOENZIM DAN PROENZIM

Enzim terdiri atas 1 atau lebih rantai polipeptia, selain itu terdapat pula bagian yang bukan protein yang penting untuk aktivitas katalitik. Bagian yang bukan protein ini disebut KOFAKTOR Kofaktor dibagi menjadi: 1. Gugus prostetik 2. Koenzim 3. ion metal Gugus prostetik: senyawa organik yang mengikat dengan kuat kepada apoenzim Koenzim: senyawa organik yang berasosiasi dengan apoenzim dan bersifat sewaktu (tidak permanen), biasanya pada saat berlangsung katalisis. Selanjutnya koenzim yang sama bisa menjadi kofaktor pada enzim yang berbeda. Kebanyakan komponen koenzim adalah vitamin.
47
Company Logo

Beberapa contoh enzim yang memerluakn kofaktor Kofaktor 1. Gugus prostetik Hem FAD 2. Kenzim FMN TPP (tiamin pirofosfat) NAD Lipoat 3. Ion metal Zn++ Cu++ Mg++ Enzim katalase, peroksidase suksinat dehidrogenase Enzim Enzim Enzim Enzim dehidrogenase dekarboksilase dehidrogenase dekarboksilase

Karbonik peptidase Asam askorbat oksidase heksokinase

48
Company Logo

12

KEGUNAAN BIOMEDIS ENZIM

Isoenzim: enzim tertentu terdiri atas beberapa tipe, semua tipe dapat mengkatalis reaksi yang sama tetapi mempunyai sifat fisik yang berbeda. Apoenzim: enzim yang tidak memiliki koenzim sehingga tidak dapat menjalankan fungsi enzimatiknya, sehingga dianggap sebagai enzim yang belum sempurna. Holoenzim: gabungan antara apoenzim dan koenzim yang secara keseluruhan mampu menjalankan fungsi enzimatik. Proenzim (zimogen): enzim yang disekresikan dalam bentuk yang belum aktif. Contoh: tripsinogen, kimoteripsinogen, pepsinogen
49
Company Logo

Enzim fungsional: enzim intrasel atau ekstrasel yang masih melakukan fungsi reaksi enzimatis.Contoh enzim ekstrasel: lipoprotein lipase, proenzim untuk pembekuan darah Enzim nonfungsional:Jika sel mengalami kerusakan, maka enzim intrasel keluar dan masuk ke dalam peredaran darah dan tidak berfungsi. Kegunaan enzim di klinik: 1. Sebagai alat diagnostik suatu penyakit (abnormalitas) 2. Untuk mengetahui perjalanan suatu penyakit. 3. Untuk mengetahui respon terhadap terapi

50

Company Logo

Bahan Bacaan
Aisjah Girindra. 1990. Biokimia I. Penerbit PT. Gramedia Jakarta. Hal. 91-113 Murray RK, dkk. 2003. Biokimia Harper. Penerbit Buku Kedokteran, EGC. Hal. 70-113 McGilvery dan Goldstein. 1996. Biokimia suatu pendekatan fungsiona. Airlangga University Press. Hal. 299-339 Sadikin M. 2002. Biokimia Enzim. Widya Medika. 379 halaman Meisenberg, G dan Simmons WH. 2006. Principles of Medical Biocemistry. Hal. 43-68. Elsivier Mosby

suarsana65@yahoo.com

LOGO

51

Company Logo

52

13