Laporan Praktikum Biokimia

Hari/tanggal : Selasa, 1 Oktober 2013 Waktu : 11.00-12.40 WIB PJP : Puspa Julistia Puspita, S.Si,M.Sc Asisten : Resti Siti Mutmainah, S.Si Lusianawati, S.Si

PROTEIN II Kelompok III Muhamad Ivan Abror J3L112184 Fika Muthia Kanza J3L112049 Rika Ussy Perdani J3L112107

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

Pendahuluan Manusia memerlukan energi untuk melakukan kegiatan dan aktivitas sehari - hari, energi tersebut dapat diperoleh dari berbagai bahan makanan. Secara umum, bahan makanan tersebut mengandung karbohidrat, protein, dan lemak. Protein merupakan biopolimer polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein merupakan biopolimer yang multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel maupun jaringan dan organ, sebagai enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau pembawa senyawa atau zat ketika melalui biomembran sel, dan sebagai zat pengatur (Hawab 2004). Protein merupakan suatu polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung unsur-unsur C, H, O, N, P, S dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga. Ikatan peptida dalam struktur primer protein dapat diuji dengan uji biuret (Winarno 2002). Protein merupakan komponen terpenting atau komponen utama sel hewan dan sel manusia. Karena sel merupakan penyusun tubuh manusia, maka protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh. Akan tetapi, struktur protein tidak setabil karena mudah mengalami denaturasi yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversible maupun irreversible. Ada berbagai cara dalam pengujian terhadap protein yaitu dengan reaksi uji asam amino dan reaksi uji protein yaitu berdasarkan pada pengendapan oleh garam, pengendapan oleh

logam dan alkohol serta uji koagulasi dan denaturasi protein (Poedjiadi 2009). Albumin adalah protein yang dapat larut dalam air serta dapat terkoagulasi oleh panas. Albumin terdapat dalam serum darah dan putih telur (Poedjiadi 2009). Denaturasi protein dapat diartikan suatu perubahan atau modifikasi terhadap struktur skunder, tersier, dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Denaturasi dapat terjadi karena beberapa hal yaitu karena pengaruh pH, panas, pelarut, logam berat, garam, kekuatan ion, dan radiasi, oleh karenanya denaturasi dapat diartikan sebagai suatu proses

terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan molekul protein (Winarno 2002).

Tujuan Percobaan bertujuan menunjukkan sifat dan struktur protein dan mempelajari beberapa reaksi uji terhadap protein melalui uji pengendapan oleh logam, pengendapan oleh garam, uji koagulasi, pengendapan oleh alkohol dan denaturasi protein.

Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan ialah penangas air, pipet, tabung reaksi dan alatalat gelas lainnya. Bahan-bahan yang digunakan ialah larutan protein (putih telur), HgCl2 2%, Pb-asetat 5%, AgNO3 5%, kristal (NH4)2SO4, pereaksi Milon, pereaksi biuret, asam asetat 1 M, HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M, buffer asetat pH 4,7, etanol 95%, aquades, dan kertas saring.

Metode Percobaan Pengendapan oleh logam pada uji protein dilakukan dengan cara albumin sebanyak 3mL ditambahkan dengan 5 tetes larutan HgCl2 2%, Pb-asetat 5% dan AgNO3 5%. Perubahan yang terjadi diamati. Pengendapan oleh garam dilakukan dengan cara larutan protein sebanyak 10 ml dijenuhkan dengan (NH4)2SO4. Penjenuhan dilakukan dengan penambahan larutan (NH4)2SO4 sedikit demi sedikit hingga mencapai titik jenuh. Larutan kemudian disaring. Uji kelarutan endapan dilakukan dengan melarutkan endapan yang terbentuk dengan air, kemudian dilakukan uji milon untuk endapan yang terbentuk dan uji biuret untuk filtratnya. Uji koagulasi dilakukan dengan cara asam asetat 1 M sebanyak 2 tetes ditambahkan ke dalam 5 mL larutan protein. Tabung kemudian diletakkan dalam penangas air selama 5 menit. Endapan yang terbentuk diambil dengan batang pengaduk. Setelah itu uji kelarutan dilakukan dengan air, kemudian dilakukan uji milon untuk endapan yang terbentuk dan uji biuret untuk filtratnya. Pengendapan oleh alkohol dan denaturasi protein dilakukan dengan cara 4 tabung reaksi disiapkan dan diisi dengan larutan protein sebanyak 5 mL, kemudian ke dalam masing-masing larutan ditambahkan HCl 0,1 M, NaOH 0,1 M, buffer asetat pH 4,7 dan alkohol 95%. Perubahan yang terjadi diamati, Setelah

itu, campuran dipanaskan dalam penangas air selama 5 menit. Perubahan setelah pemanasan diamati. Denaturasi protein dilakukan dengan cara 3 tabung reaksi disiapkan dan diisi dengan larutan albumin sebanyak 4.5mL, ke dalam masing - masing larutan ditambahkan dengan HCl 0.1 M, NaOH 0.1 M, dan buffer asetat pH 4,7 kemudian larutan dipanaskan selama 15 menit. Perubahan warna diamati. Buffer asetat pH 4.7 sebanyak 5mL ditambahkan kedalam tabung 1 dan 2, perubahan yang terjadi diamati kembali. Hasil dan Pembahasan Tabel 1 Hasil uji pengendapan albumin oleh logam berat Logam berat HgCl2 Pb-asetat AgNO3 Hasil pengamatan (+/-) + +++ ++ Perubahan warna larutan Larutan keruh, ada endapan putih Larutan keruh, ada endapan putih Larutan keruh, ada endapan putih

Keterangan (+) Logam berat mengendapkan protein (-) Logam berat tidak mengendapkan protein

(a)

(b)

(c)

Gambar 1 Hasil uji pengendapan albumin oleh logam berat HgCl2 (a), Pb-asetat (b), AgNO3 Tabel 2 Hasil uji pengendapan albumin oleh (NH4)2SO4 Uji Uji kelarutan Uji millon Uji biuret Hasil pengamatan (+/-) + Perubahan warna larutan Larut Putih susu Biru

Keterangan (+) Garam mengendapkan protein (-) Garam tidak mengendapkan protein

(a)

(b)

(c)

Gambar 2 Hasil uji pengendapan albumin oleh (NH4)2SO4 uji biuret (a), uji Millon (b), uji kelarutan (c) Tabel 3 Hasil uji pengaruh pemanasan terhadap albumin Uji Uji kelarutan Uji Millon Uji biuret Hasil pengamatan (+/-) + Perubahan warna larutan Tidak larut Ada endapan putih Violet

Keterangan (+) Pemanasan mengendapkan protein (-) Pemanasan tidak mengendapkan protein

(a)

(b)

(c)

Gambar 3 Hasil uji koagulasi uji biuret (a), uji Millon (b), uji kelarutan (c) Tabel 4 Hasil uji pengendapan albumin oleh alkohol Larutan Albumin + HCl Albumin + NaOH Albumin + buffer asetat pH 4.7 Albumin + etanol Hasil pengamatan (+/-) + + + Perubahan warna Ada endapan putih Tidak ada endapan Ada endapan putih Ada endapan putih

Keterangan (+) Alkohol mengendapkan protein (-)Alkohol tidak mengendapkan protein

Gambar 4 Hasil uji pengendapan albumin oleh alkohol Tabel 5 Hasil uji denaturasi albumin Hasil Larutan Albumin + HCl Albumin + NaOH Sebelum pemanasan Ada gumpalan putih Tidak ada gumpalan, larutan kuning bening seulas Ada gumpalan Setelah pemanasan Gumpalan putih bertambah Tidak ada gumpalan, larutan kuning bening Gumpalan semakin bertambah (b) (c) Setelah penambahan buffer asetat 4.7 Gumpalan putih semakin bertambah Tidak ada gumpalan, larutan kuning keruh

Albumin + buffer

(a)

Gambar 5 Hasil uji denaturasi albumin, albumin + HCl (a), albumin + NaOH (b), albumin + Buffer (c) Percobaan pengendapan oleh logam, dasar reaksi pengendapan protein oleh logam berat adalah penetralan muatan. Pada pH alkalis dari titik isolistriknya protein bermuatan negatif dengan adanya ion positif dari logam, akan terjadi penetralan muatan dan protein mendekati titik isoelektris sehingga mengendap. Endapan akan larut dengan penambahan alkali encer. Senyawa senyawa logam tersebut akan memutuskan jembatan garam dan berikatan dengan protein

membentuk endapan logam proteinat (Winarno 2002). Reaksi dapat dilihat pada gambar 6.

Gambar 6 Reaksi pengendapan protein oleh logam (Poedjiadi 2009) berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, diperoleh semua logam berat yang ditambahkan pada larutan albumin menghasilkan endapan, hal ini terjadi karena protein mengalami presipitasi bila bereaksi dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif (logam) diperlukan pH larutan diatas pI karena protein bermuatan negatif, pengendapan oleh ion negatif diperlukan pH larutan dibawah pI karena protein bermuatan positif. Ion ion positif yang dapat mengendapkan protein ialah Ag+, Ca+, Zn+, Hg+, Fe+, Cu+, dan pb+, sedangkan ion ion negatif yang dapat mengendapkan protein ialah ion salisilat, trikloroasetat, tanat, dan sulfosalisilat (Poedjiadi 2009) Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) hingga jenuh (Poedjiadi 2009). Berdasarkan percobaan setelah larutan albumin dijenuhkan dengan ((NH4)2SO4), uji endapan yang terbentuk dengan air menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan larutnya endapan protein dalam air, uji millon yang dilakukan pada endapan menunjukkan hasil negatif yang ditandai dengan terbentuknya wearna putih susu pada larutan karena hasil positif pada uji millon ditandai dengan terbentuknya warna merah (Page 1997), uji biuret yang dilakukan pada filtrat juga menunnjukkan hasil negatif yang ditandai dengan terbentuknya warna biru karena hasil uji positif uji biuret adalah warna violet (Sukardjo 2009). Pengujian endapan yang dihasilkan dengan pereaksi millon bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin, sedangkan pengujian filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan. Hasil negatif uji biuret pada filtrat menunjukkan bahwa sudah tidak ada gugus amida pada filtrat, namun uji millon juga menunjukkan hasil negatif, seharusnya uji millon menunjukkan hasil positif karena endapan yang terbentuk merupakan albumin, albumin termasuk protein lengkap yang dibangun oleh sejumlah asam

amino esensial dan non esensial diantaranya adalah tirosin (Page 1997), hasil negatif yang didapatkan mungkin disebabkan karena pereaksi yang digunakan sudah tersimpan lama dan ada kemungkinan pereaksi telah terkontaminasi. Percobaan menggunakan ((NH4)2SO4) karena ((NH4)2SO4) memiliki tingkat

kelarutan yang lebih tinggi dari pada protein. Sehingga pada saat penambahan ((NH4)2SO4) , amonium sulfat akan melarut dalam air dan mendesak protein

keluar, kembali dalam bentuk solidnya, sehingga terbentuk protein yang terendapkan (Poedjiadi 2009). Proses ini terjadi karena adanya kompetisi antara molekul protein dengan ion anorganik dalam mengikat air (hidrasi) (Sumarjo 1998). Salting out adalah pengendapan protein dari sampel sedangkan salting in pengendapan protein dari sampel dan endapan tersebut dapat larut kembali jika ditambahkan pelarut. Percobaan uji koagulasi menggunakan prinsip denaturasi protein dan titik isolistrik. denaturasi yaitu keadaan dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversible maupun irreversible (Poedjiadi 2009). Sedangkan yang dimaksut titik isolistrik adalah suatu keadaan dimana ion negatif dan ion positif yang ada pada suatu molekul jumlahnya sama dan mengindikasikan kenetralan, pH ketika terjadi isolistrik disebut pI (pH isolistrik). Besarnya pI untuk albumin adalah sebesar 3.5 4.5 (vlasova 2003). Berdasarkan percobaan uji kelarutan dalam air menunjukkan hasil negatif, uji millon juga menunjukkan hasil negatif, uji millon betujuan untuk mengetahui adanya asam amino tirosin yang menghasilkan warna merah (Page 1997). Seharusnya uji millon menunjukkan hasil positif karena albumin yang terendapkan mengaandung tirosin hal ini sesuai dengan pernyataan Page (1997) yang menyaatakan bahwa albumin termasuk protein lengkap yang dibangun oleh sejumlah asam amino esensial dan non esensial diantaranya adalah tirosin. Tidak terbentuknya warna merah pada larutan mungkin disebabkan karena pereaksi millon yang digunakan tidak dalam keadaan fress dan telah terkontaminasi. Uji biuret untuk filtratnya menunjukkan hasil positif yang mengindikasikan bahwa masih ada ikatan peptida antar asam amino yang terdapat dalam filtrat. Penambahan asam asetat 1 M ke dalam larutan protein menyebabkan ion - ion H+ dari asam akan terikat pada gugus gugus yang bermuatan negatif sehingga terjadi perubahan pengutuban dari molekul protein.

Perubahan pengutuban ini menyebabkan perubahan konfirmasi dari protein atau rusaknya struktur tersier atau struktur kuartener protein sehingga protein mengalami koagulasi (Fessenden 1986). Pengendapan oleh alkohol, Penambahan alkohol dapat menurunkan konstanta dielektrik pada larutan sehingga gaya tarik menarik antar molekul menjadi semakin kuat. Alkohol akan mengoksidasi gugus positif pada asam amino untuk bereaksi dengan gugus negatif yang ada dalam larutan, yang mengakibatkan pada suasana tertentu dapat membentuk endapan, dalam percobaan albumin yang ditambahkan buffer pH 4,7 menghasilkan endapan paling banyak. Hal ini disebabkan pada pH 4,7 terdapat titik isoelektrik protein sehingga endapan yang terbentuk merupakan jumlah endapan yang maksimal. Albumin sendiri memiliki titik isoelektrik pada pH 4,5 - 4,9 (Poedjiadi 2009). Berdasarkan hasil percobaan, dapat dilihat pada Tabel 4, hanya albumin yang ditamnbahkan NaOH yang memberikan hasil negatif, hal ini disebabkan karena titik isoelektrik protein terlalu jauh dalam suasana basa. Albumin yang ditambahkan HCl akan membentuk endapan namun dengan kuantitas yang lebih sedikit. Endapan yang terbentuk sedikit karena gugus positif pada protein berikatan dengan gugus Cl dan gugus negatif yang ada pada larutan sehingga endapan yang terbentuk dalam suasana asam lebih sedikit. Denaturasi protein adalah berubahnya bentuk dan lipatan molekul protein tetapi tidak sampai memutuskan ikatan antar asam amino dalam struktur protein. Hal itu dikarenakan denaturasi tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan. Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur skunder dan tersier protein . denaturasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi protein (Ophart 2003). Denaturasi dapat terjadi karena beberapa hal yaitu karena pengaruh pH, panas, pelarut, logam berat, garam, kekuatan ion terlarut, dan radiasi. Denaturasi memiliki derajat yang bertingkat , dari yang ringan yaitu bersifat reversible sampai yang berat yang bersifat irreversible (Hawab 2003). Berdasarkan percobaan dapat dilihat pada Tabel 5 hanya albumin yang ditambahkan NaOH yang tidak menghasilkan endapan hal ini karena titik isoelektrik protein terlalu jauh dalam suasana basa. Penambahan buffer pH 4.7 pada albumin yang ditambahkan HCl menyebabkan endapan semakin bertambah, hal ini

dikarenakan albumin sendiri memiliki titik isoelektrik pada pH 4,5-4,9 (Poedjiadi 2009). Titik isolistrik pada protein mempunyai arti pentingkarena pada umumnya sifat fisika dan kimia erat hubungannya dengan pH isolistrik., pada pH diatas titik isolistrik protein bermuatan negatif, sedangkan dibawah titik isolistrik protein bermuatan positif. Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Protein telur mengalami denaturasi dan terkoagulasi selama pemanasan (Ophart 2003). Panas dapat digunakan untuk mengacaukan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar. Hal ini terjadi karena suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan molekul tersebut. Protein telur mengalami denaturasi dan terkoagulasi selama pemanasan (Ophart 2003).

Simpulan Berdasarkan hasil percobaan, logam berat (Ag, Hg dan Pb) akan membentuk ikatan logam proteinat ketika direaksikan dengan larutan protein. Kelarutan protein berkurang ketika ditambahkan garam-garam anorganik, sehingga terbentuk endapan. Koagulasi dan denaturasi protein disebabkan akibat pemanasan dan penambahan alkohol. Daftar Pustaka Fessenden. 1986. Kimia Organik jilid 1. Pudjaatmaka AH, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta: Bayu Media Publishing. Ophart, C.E. 2003. Virtual Chembook. Elmhurst College. Page, DS. 1997. Prinsip-prinsip Biokimia. Jakarta: Erlangga. Poedjiadi, Anna dkk. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press. Sukardjo, Drs. Kimia Dasar Universitas. Jakarta : Erlangga. Winarno, F. 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia: Jakarta.