KARYA ILMIAH

UJI BIOKIMIA BAKTERI

Oleh: Sri Agung Fitri Kusuma, M Si , A!t

U"I#ERSITAS $A%JA%JARA" FAKULTAS FARMASI FEBUARI &''(

$E"%AHULUA" Pengujian mikrobiologi dilakukan untuk memberikan perlindungan kepada

masyarakat bahwa makanan atau produk yang digunakan layak untuk dikonsumsi. Ruang lingkup pemeriksaan di Laboratorium Mikrobiologi di Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan adalah uji cemaran bakteri dan jamur pada produk makanan dan minuman, obat tradisional, kosmetik, alat kesehatan, pengujian antibiotika dan sterilitas. Pengujian-pengujian tersebut dilakukan sesuai prosedur tetap yang diberlakukan di Laboratorium Mikrobiologi Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan sesuai dengan tandar !asional "ndonesia # !"$ dan standar acuan lain yang telah di%eri&ikasi. 'asil pengujian cemaran mikroba pada sampel makanan-minuman, obat tradisional dan kosmetika hampir secara keseluruhan memenuhi persyaratan. !amun pada pengujian kapang dan khamir untuk minuman ringan dan sirup serta (ngka Lempeng )otal #(L)$ pada bakso daging terdapat beberapa sampel yang tidak memenuhi syarat. *alaupun dilakukan dengan metode yang sama %ariasi hasil dalam satu jenis sampel dapat disebabkan oleh berbagai &aktor, salah satunya adalah cara pengolahan+pembuatan sampel oleh pihak produsen. 'al ini tentunya berkaitan dengan pemahaman dan tingkat pengawasan dari produsen itu sendiri dalam proses produksi makanan, minuman, obat tradisional, dan kosmetika. ,alam melakukan pengujian mikrobiologi, haruslah dimengerti jenis-jenis nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroba dan juga lingkungan &isik yang dapat menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya. Mikroba amat beragam baik dalam persyaratan nutrisi maupun &isiknya. Perbedaan nutrisi dan lingkungan &isik mikroba dapat mempermudah dalam menumbuhkan mikroba yang diuji sesuai dengan persyaratan. -mumnya mikroba yang dilakukan pengujiannya di laboratorium mikrobiologi adalah bakteri dan jamur #kapang dan khamir$. Perbedaan antara jamur dan bakteri ini menyebabkan media yang digunakan untuk pengujian terhadap jamur dan bakteri juga berbeda, demikian pula dengan perlakuan &isiknya #inkubasi$.

II

ME%IA $E")UJIA" Pada pengujian mikrobiologi, bakteri dibiakkan dalam bahan berisi nutrisi

yang disebut media. Media dapat berupa cairan seperti kaldu dan dapat pula berupa padatan seperti agar dan gelatin. Media pengkaya adalah media yang dapat menunjang pertumbuhan bakteri yang memiliki persyaratan nutrisi yang rumit agar dapat tumbuh dengan optimal, contohnya adalah Tryptic Soy Broth #) B$, MacConkey Broth #M.B$, dan Lactose Broth #LB$. Media di&erensial merupakan media yang dapat menumbuhkan beberapa jenis bakteri dan menyebabkan kolonikoloni suatu bakteri tertentu mendapatkan bentuk yang khas, contohnya adalah Eosin Methylene Blue Agar #/MB($ yang dapat menumbuhkan bakteri kelompok /nterobacteriaceae, salah satunya adalah E. coli yang akan tumbuh dengan membentuk koloni berwarna hijau dengan kilap logam. edang media selekti& adalah media yang mengandung 0at kimia tertentu yang dapat menghambat pertumbuhan satu kelompok bakteri atau lebih tanpa menghambat pertumbuhan bakteri yang diinginkan, contohnya Bismuth sulfith Agar #B ($ untuk Salmonella, dan Vogel Johnson Agar #12($ untuk Staphylococcus. Media padat yang paling banyak digunakan adalah agar-agar, karena bila agar-agar sudah menjadi padat masih dapat dicairkan kembali untuk digunakan. elain itu, suspensi agar-agar 3,4-5 6 dalam air karena dapat larut pada suhu 3777. dan tidak menjadi padat sebelum suhu turun di bawah 84 7. kemudian media agar didinginkan dengan cepat sehingga menjadi padat tanpa merusak selsel tersebut. ekali menjadi padat, agar tidak dapat mencair kembali, kecuali jika dipanaskan di atas 977.. Pada metode lempeng tuangan, suatu suspensi sel dicampur dengan agar-agar cair pada suhu 477. dituang pada cawan petri. Bila agar-agar telah mengeras, sel tidak akan bergerak lagi dan tumbuh menjadi koloni sangat besar kemungkinannya berasal dari satu sel yang sama. -ji (ngka Lempeng )otal #(L)$ dilakukan untuk menentukan jumlah atau angka bakteri aerob meso&il yang mungkin mencemari suatu produk, baik itu makanan-minuman, obat tradisional ataupun kosmetika. Media yang digunakan untuk uji (L) adalah P.( # late Count Agar$. Masa inkubasi dilakukan dengan

membalik cawan petri yang berisi biakan. 'al ini dimaksudkan untuk menghindari jatuhnya butir air hasil pengembunan disebabkan suhu inkubator. (pabila sampai terdapat air yang jatuh maka akan merusak pembacaan angka lempeng total dari sampel yang diuji. .ara inokulasi yang dipilih adalah cara tuang, dimana hal ini dimaksudkan untuk melihat pertumbuhan bakteri aerob meso&il, yang membutuhkan oksigen dalam pertumbuhannya, sehingga akan teramati bahwa pertumbuhan bakteri aerob meso&il tersebut akan berada dipermukaan lempeng agar, karena pertumbuhannya yang mencari oksigen.Oleh karena itu, pada pengamatan angka lempeng total ini, dicari hanya koloni bakteri yang tumbuh di permukaan lempeng agar. Media P.( yang digunakan untuk uji (L) ini terlebih dahulu ditambahkan )). 7.4 6 #trifeniltetra!olium klori"a$. )). ini ber&ungsi sebagai indikator yang akan direduksi sehingga mewarnai koloni bakteri yang hendak diamati, dengan demikian dapat dibedakan dengan kotoran yang mungkin berasal dari sisa-sisa sampel yang dapat mengganggu pengamatan koloni bakteri. )). yang ditambahkan adalah 3 mL dalam 3777 mL media P.(. )). akan direduksi dengan cepat menjadi &orma0an yang berwarna merah dan tidak larut. ,alam pengujian untuk angka lempeng total sering digunakan untuk indikator koloni karena kebanyakan bakteri aerob meso&il dapat mereduksi )). menjadi &orma0an sehingga meskipun dalam medium yang keruh karena terdapat matriks sampel yang kompleks, koloni dapat terlihat jelas. )). dapat dibentuk dari hasil reaksi antara #en!ene"ia!onium klori"a dengan #en!alphenylhy"ra!on pada suasana alkali, yang kemudian disusul oleh oksidasi pada cincin dia0onium. -ntuk reaksi sebaliknya maka )). direduksi dalam suasana basa lemah menjadi &orma0an yang berwarna merah.

:ambar 8.3 Reaksi Reduksi Triphenyltetra!olium Chlori"e #)).$ Menjadi ;orma0an

N+

.lN

<

H C

HN

alkaline medium O=idation

N N+

ben0enedia0onium chloride

ben0alphenylhydra0one

)).

:ambar 8.5 intesis )).

'asil pengujian (L) untuk beberapa sampel yang diuji, termasuk sampel makanan-minuman, obat tradisional, dan kosmetik, pada umumnya memenuhi syarat. (kan tetapi, ada juga sampel obat tradisional yang tidak memenuhi syarat. "ni mengindikasikan bahwa perusahaan yang memproduksi produk tersebut belum menerapkan cara produksi yang higienis. elain itu, kontaminasi mikroba mungkin juga karena kesalahan penguji atau peralatan pengujian yang kurang bersih. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengujian ulang dengan personal yang berbeda dengan personal pertama.

Pada pengujian angka kapang+ khamir digunakan pengencer P,; yang mengandung nutrisi pepton yang baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir serta menggunakan media otato $e%trose Agar #P,($ yang merupakan media padat #agar$ dengan kandungan nutrisi karbohidrat #dektrosa$ yang baik untuk pertumbuhan kapang dan khamir. "nkubasi sampel dilakukan pada suhu 57-54 7. yang merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan kapang dan khamir. "nkubasi sampel tidak boleh diposisikan terbalik karena kapang+ khamir akan tumbuh dan memiliki spora yang terus berkembang biak, jika posisi cawan dibalik maka spora &ungi tersebut akan bertebaran dan tumbuh dimana-mana pada media (gar, sehingga jumlah koloni &ungi yang tumbuh akan semakin banyak dari jumlah koloni sebenarnya, hal ini dapat menyebabkan kesalahan perhitungan koloni kapang+ khamir. Pada media P,( ditambahkan klorampenikol sebanyak 37 mg+377 mL dengan tujuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri sehingga yang akan tumbuh pada media tersebut hanya kapang dan khamir. Pada pengujian sampel, meskipun hasil (L) dan angka kapang+ khamir memenuhi syarat, tetap harus dicurigai karena tidak adanya atau sedikitnya pertumbuhan bakteri dan kapang+ khamir bisa disebabkan oleh adanya pengawet dalam sampel. Oleh karena itu, harus dilakukan pengujian secara kimia untuk memastikan ada atau tidaknya pengawet dalam sampel tersebut, dan bila positi&, harus diketahui berapa kadar pengawetnya, apakah masih memenuhi syarat atau tidak. 2ika suatu sampel walaupun memenuhi syarat secara mikrobiologi, belum tentu memenuhi syarat secara kimia dan begitu juga sebaliknya. -ntuk sampel makanan-minuman, obat tradisional, dan kosmetik yang diduga menggunakan pengawet digunakan pengencer yaitu Letheen Broth #LB$ yang dapat menginakti%asi pengawet dalam sampel karena mengandung lesitin 7,46 yang ber&ungsi sebagai inakti%ator, sehingga hasil pengujian yang negati& dari sampel benar-benar menunjukkan hasil yang negati& bukan karena akti%itas dari pengawet. edangkan untuk sampel tanpa pengawet, pengenceran dilakukan dengan menggunakan epton $ilution &lui" #P,;$.

III

TEK"IK $E")UJIA" Bakteri yang paling banyak digunakan sebagai indikator sanitasi adalah

Escherichia coli karena bakteri ini adalah bakteri komensal pada usus manusia dan umumnya bukan patogen penyebab penyakit. Escherichia coli adalah bakteri gram negati& berbentuk batang yang tidak membentuk spora dan merupakan &lora normal di usus. Meskipun demikian, beberapa jenis E. coli dapat bersi&at patogen, yaitu serotipe-serotipe yang masuk dalam golongan E. coli /nteropatogenik, E. coli /nteroin%asi&, E. coli /nterotoksigenik, dan E. coli /nterohemoragik. 2adi, adanya E. coli dalam air minum menunjukkan bahwa air minum itu pernah terkontaminasi kotoran manusia dan mungkin dapat mengandung patogen usus. Oleh karena itu, standar air minum mensyaratkan E. coli harus bebas dalam 377 mL sampel. -ji Escherichia coli dilakukan pada beberapa jenis sampel makananminuman dan beberapa jenis sampel obat tradisional. -ntuk uji E. coli syarat negati& berarti perlu dilakukan pengkayaan dengan media Lactose Broth yang mengandung laktosa. ,engan kandungan laktosanya, media ini dapat di&ermentasikan oleh bakteri E. coli. Media selekti& yang digunakan adalah /MB(. -ntuk uji E. coli syarat kurang dari, tidak perlu dilakukan tahap pengkayaan terlebih dahulu. -ji E. coli dapat juga dilakukan dengan metode MP! dengan menggunakan media yang sama, yaitu M.B, karena bakteri ini juga termasuk ke dalam bakteri coli&orm.

:lukosa !(,'5

(s. Piru%at <

(s. (setat <

.O5

!(, (s. Laktat !(,'5

!(, (setaldehida+ .'>.'O !(,'5

!(, /tanol+ .'>.'5O'

:ambar 8.> ;ermentasi :lukosa Oleh Bakteri E. coli

)eknik Most memperkirakan

ro#a#le 'um#er #MP!$ merupakan metode untuk terutama pada situasi dimana

populasi mikroorganisme

mikroorganisme ada dalam jumlah yang sangat sedikit. Pengujian MP! Coliform dan Escherichia coli menggunakan media Mac Conkey Broth #M.B$ dan tabung ,urham. M.B merupakan media perbenihan selekti& yang mengandung garam empedu sebagai penghambat bakteri bukan coli&orm. )abung ,urham digunakan untuk mengetahui adanya pembentukan gas oleh bakteri yang terdapat dalam sampel tersebut. )erbentuknya gas dan asam menandakan adanya Escherichia coli dan bakteri Coliform. 2ika hanya terbentuk gas menandakan adanya Coliform tanpa ada Escherichia coli. )erbentuknya asam ditandai dengan perubahan warna biakan menjadi kuning. )ahap ini merupakan uji presumti&. ampel yang menunjukkan uji presumti& positi& dilanjutkan ke uji kon&irmasi. -ji kon&irmasi Coliform menggunakan media Brilliant (reen Lactose Bile #B:LB$ dengan melihat terbentuknya gas dalam tabung ,urham. -ji kon&irmasi Escherichia coli dilanjutkan ke Escherichia coli Broth #/.B$ dan diinkubasi pada suhu optimum Escherichia coli yaitu 887.. -ji kon&irmasi dinyatakan positi& bila terbentuknya gas dalam tabung ,urham, kemudian

dilanjutkan dengan menggores ke media Eosin Methylen Blue Agar #/MB($ yang merupakan media di&erensial untuk Escherichia coli. ?oloni spesi&ik tumbuh dengan ciri-ciri bentuk bulat, diameter 5-> mm, warna hijau dengan kilap logam dan bintik biru kehijauan di tengahnya. atu koloni spesi&ik yang terpisah diinokulasikan pada media !( miring untuk memperbanyak biakan koloni. ?emudian dilanjutkan dengan uji biokimia yang terdiri dari uji indol, uji merah metil, uji Voges) roskauer, dan uji sitrat. -ji "ndol positi& ditandai dengan terbentuknya cincin yang berwarna merah cerry di permukaan biakan apabila ditambahkan beberapa tetes pereaksi ?o%ac@s yang terdiri dari p-dimetilaminoben0aldehid, butanol, dan asam. -ji ini menggunakan media Tryptone Broth yang mengandung substrat tripto&an. Reaksi positi& terjadi karena tripto&an dikon%ersi menjadi indol. -ji metil merah positi& ditandai biakan yang berwarna merah apabila ditambahkan 4 tetes larutan metil merah dan dikocok. *arna merah terjadi karena &ermentasi glukosa menghasilkan asam.

CH2

CH

COOH

)ryptophanase

CH3

<C
NH2 N H N H

O < !'>

COOH

)ryptophan
CHO

"ndole Taha! *

Pyru%ic acid

<
N H N (CH3)2

'.l (lcohol ,ehydration reduction

HN

N+ (CH3)2

"ndole

p-dimethylaminoben0aldehyde Taha! &

Auinoidal red-%iolet compound

:ambar 8.8 Reaksi -ji "ndol

:lucose < '5O

Lactic acid (cetic acid ;ormic acid

.O5 < '5 #p' 8,8$

Methyl red indicator red color

:ambar 8.4 Reaksi -ji metil merah

-ji Voges) roskauer positi& ditandai dengan warna biakan menjadi merah muda sampai merah menyala setelah ditetesi larutan al&a na&tol dan ?O' 87 6 #>B3$. Pada uji ini terjadi pembentukan asetimetilkarbinol dari dekstrosa.

:lucose < O5

(cetic acid

5,>-butanediol acetylmethylcarbinol Taha! *

.O5 < '5

CH3 C CH CH3 O OH

OH

CH3

NH2 O C NH R NH

876 ?O' <

C C CH3

O=idation

<
O

acetylmethylcarbinol

alpha-naphthol Taha! &

,iacetyl

:uanidine group o& peptone

:ambar 8.C Reaksi -ji 1oges-Proskauer

-ji sitrat positi& ditunjukkan oleh perubahan warna biakan dari hijau menjadi biru karena terbentuknya natrium karbonat hasil reaksi en0imatis yang mengubah indikator bromtimol biru pada media.

Escherichia coli dinyatakan positi& apabila uji indol dan metil merah menunjukkan hasil positi&, sedangkan uji Voges) roskauer dan uji sitrat menunjukkan hasil negati&. 2ika salah satu interpretasi hasil tidak sesuai maka biakan yang diuji dinyatakan tidak mengandung Escherichia coli.
COOH CH2 HO COOH COOH COOH

.
CH2 COOH

.itrase

C CH2

< .'>.OO' (cetic acid

C CH3

< .O5

COOH

Pyru%ic acid Taha! * (lkaline p' Taha! & .olor change &rom green to blue

.itric acid

O=alacetic acid !a5.O>

< .O5 < 5!a < '5O

:ambar 8.D Reaksi -ji itrat

Pengujian Escherichia coli, media Violet *e" Bile Agar #1RB($ dibuat sebanyak dua lapis karena E. coli bersi&at anaerob &akultati&, yaitu dapat tumbuh baik pada keadaan aerobik dan anaerobik. :as-gas utama yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri adalah oksigen dan karbondioksida. Pada pengujian Salmonella, pra-pengkayaan dimaksudkan untuk

merangsang pertumbuhan Salmonella dari keadaan tidak akti& secara &isiologis atau adanya trauma, dimana diperkirakan almonella ada dalam makanan yang telah mengalami proses pemanasan, pembekuan, penekanan dengan daya osmotik yang tinggi, dan perubahan p'. Pada umumnya, semua bahan makanan yang telah mengalami perlakuan pengeringan #dehidrasi atau dibuat bubuk$ harus mengalami pra-pengkayaan dengan media yang hanya merangsang pertumbuhan Salmonella. Makanan tersebut biasanya telah mengandung sedikit almonella yang ada memiliki sedikit kemungkinan berkompetisi dengan mikroorganisme yang lain.

edangkan pada media pengkaya biasanya mengandung bahan kimia yang secara sengaja ditambahkan untuk menghambat pertumbuhan bakteri coli&orm dan mikroorganisme lain selain Salmonella. Media pengkayaan selekti& yang paling sering digunakan adalah Tetrationat Broth #)B$ dan Selenit Cystein Broth # .B$. )B mengandung asam ampedu, tetrationat, natrium tiosul&at dan #riliant green yang dapat menghambat organisme lain selain Salmonella. edangkan .B mengandung inhibitor natrium selenit yang tereduksi menjadi selenium. elenium akan bereaksi dengan asam amino yang mengandung sul&ur untuk menghambat bakteri lainnya. Media selekti& yang digunakan untuk isolasi adalah B ( #Bismuth Sulfit Agar$. Media ini mengandung bismuth yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain. ?oloni yang berwarna hitam kecoklatan timbul karena terbentuk hidrogen sul&ida yang bereaksi dengan bismuth.

eO5-> < C'< < 8e "on selenit e < ' .'5.'.O5'

NH2

< C'5O elenium < .'>.'.O5 e ul&ur

NH2

ystein

garam-systein

:ambar 8.9 Reaksi Reduksi elenit

< O>5- < 9' <

Ce

'5 hidrogen sul&ida

< '5O

sul&it 5Bi>< < >'5 Bi5

>

<

C'<

endapan hitam

:ambar 8.E Reaksi Reduksi sul&it dan "on Bismuth

-ji Staphylococcus dilakukan, karena bakteri ini adalah salah satu yang dapat menghasilkan toksin yang berbahaya bagi manusia. Media yang digunakan untuk isolasi bakteri ini pada sampel makanan-minuman dipilih Bair" arker Agar #BP($ sedangkan pada sampel obat tradisional dan kosmetik digunakan media 12(. Media BP( mengandung litium klorida dan telurit untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain, sedangkan kandungan piru%at dan glisin dimaksudkan untuk mendukung pertumbuhan taphylococci. ?oloni yang terbentuk pada media ini berwarna hitam dan opa+ue. 'itam karena adanya reduksi tellurite membentuk tellurium, dan terbentuk cincin disekitarnya berupa 0ona bening karena terjadi proteolisis dan lipolisis dari egg)yolk yang ditambahkan. Pada media 12( koloni Staphylococcus dapat mendegradasi manitol membentuk asam yang ditandai oleh perubahan warna merah &enol pada media menjadi kuning.

< )eO>5- < C' < 8e

)e

< >'5O

)ellurit

endapan hitam
:ambar 8.37 Reaksi Reduksi )ellurite

CH2OH CHO CHOH (CHOH)3 CH2OH COOH

'!O>

(CHOH)4 CH2OH

'5O

(CHOH)4 CH2OH

,L-manitol

,L-Mannose

,L-Mannonic acid

:ambar 8.33 ,egradasi Manitol

-ji Clostri"ium perfringens dilakukan pada beberapa sampel uji makananminuman, obat tradisional dan kosmetika. Pada saat melakukan pengkayaan dengan media ;)M sehingga tidak perlu diinkubasi dalam bejana anaerob karena media ;)M mengandung tioglikolat, selain ber&ungsi sebagai agen produksi juga mempunyai %iskositas tinggi. ,engan demikian asupan oksigen akan berkurang, hal ini ditandai dengan lapisan warna merah resa0urin pada permukaan. Bakteri ini diisolasi pada media agar Sulfit olymi%in Sulfa"ia!in # P $ yang diinkubasi pada bejana anaerob dengan menggunakan anaerob indikator yang berubah warna menjadi pink ketika kontak dengan udara luar. ?emampuannya yang mereduksi sul&it menjadi sul&ida, sehingga koloni bakteri yang teramati akan berwarna hitam sebagai hasil reaksi sul&ida dengan besi sitrat. Mikroorganisme lain yang juga dapat mereduksi sul&it dihambat oleh polimiksin dan sul&adia0in #sul&a pirimidin$.

< O>5- < 9' < sul&it

Ce

'5 sul&ida

< '5O

OH COOFe H2C

OH CH2COOFe

< '5

;e5

>

< COOH

H2C

CH2COOH

COOFe
besi #"""$ sitrat

endapan hitam

as. sitrat

COOH

:ambar 8.35 Reaksi ul&ida dengan Besi #"""$ itrat

Pada uji Cetrimi"e)Agar

seu"omonas, media #.et-($. Media

yang digunakan untuk isolasi adalah ini mengandung cetrimide

#Cetyltrimethylammonium#romi"e$ yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri selain seu"omonas aeruginosa. -ji Can"i"a al#icans dilakukan pada sampel kosmetik dan obat tradisional #untuk cairan obat luar$, dimana jenis jamur ini termasuk salah satu yang berbahaya karena dapat membentuk germ tu#e pada serum manusia dan mamalia. ,ari hasil pengamatan pada inter%al tertentu dan pada akhir periode inkubasi, tidak ada pertumbuhan Can"i"a al#icans, artinya sampel memenuhi syarat.