ASISTENSI DAN PENJELASAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI SISTEM RESPIRASI

24/02/2010

Fakultas Kedokteran Universitas Hasanuddin Makassar, Februari 2010

PEMBAGIAN KELOMPOK / ASISTEN PRAKTIKUM RESPIRASI

A1 B1A9
A2B2 A3B3 A4B4 A5B5B9 A6B6 A7B7

:
: : : : : :

LAODE MALI RAY

DERVIN ARIANSYAH RUQNUDDIN IRFAN ADI SAPUTRA RINI MAGFIRAH AMINAH RAFIQAH NURDIN

A8B8
24/02/2010

HASMIA
2

TATA-TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI SISTEM RESPIRASI

Mengumpulkan Tugas Pendahuluan, dianggap ACC oleh Asisten Hadir Asistensi Ikut dan LULUS Respon Baca Penuntun Praktikum

PRA

PRAKTIKUM

Bawa Handscoen dan Masker, Penuntun Praktikum (Katrol diisi + foto) Pake jas lab + Name tag, tidak pake jeans, kaos oblong, sandal

POST
24/02/2010

Kumpul Laporan Praktikum paling lambat hari Rabu, 12.00 WITA @ Departemen Mikrobiologi FK UH

 Karakteristik dari : Mycobacterium tuberculosis Klebsiella pneumoniae

Spesimen Pemeriksaan Pemeriksaan Laboratorium Konsentrasi Sputum Pewarnaan Gram & Tahan Asam BAKTERI PENYEBAB PENYAKIT PADA SALURAN PERNAFASAN DIAGNOSIS LABORATORIUM PENYAKIT INFEKSI SALURAN NAFAS

TES BIOKIMIA

MEDIUM SPESIFIK UNTUK ISOLASI MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Medium Lowenstein Jensen
4

TSI SIM MR/VP Citrate test Urea Hydrolysis 24/02/2010 Sugar fermentation test

DIAGNOSIS LABORATORIUM PENYAKIT INFEKSI SALURAN NAFAS BAHAN PEMERIKSAAN: Infeksi saluran nafas bagian Atas : apusan tenggorok, darah Infeksi nafas bagian bawah: Sputum Bilas bronchus
24/02/2010 5

TAHAPAN PEMERIKSAAN LABORATORIUM UNTUK MENDIAGNOSIS PENYAKIT INFEKSI SALUTAN NAFAS

1. Preparat langsung dari sputum atau bilas bronchus yang diwarnai Gram dan/atau tahan asam. 2. Isolasi dan identifikasi: Bentuk dan sifat koloni Bentuk & sifat pewarnaan Sifat-sifat biokimia. 3. Tes Kepekaan antibiotik
24/02/2010 6

LABORATORY EXAMINATION

24/02/2010

Mycobacterium tuberculosis
Karakteristik : 1. Berbentuk batang lurus atau agak bengkok dengan ukuran 0,2 - 0,4 x 1 - 4 um. 2. Tumbuh lambat, koloni tampak setelah lebih kurang 2 minggu bahkan stelah 6-8 minggu 3. Suhu optimum 35-37C, tidak tumbuh pada suhu 25C atau lebih dari 40C. 4. Tidak tahan panas dan sinar UV, akan mati pada 6C selama 15-20 menit 5. Biakan dapat mati jika terkena sinar matahari langsung selama 2 jam. 6. Bakteri Tahan asam 7. Bersifat non motil, non spora, non kapsul 8. Tidak dapat tumbuh pada medium kultur biasa hanya pada enriched media egg-based, yaitu LOWENSTEIN JENSEN MEDIUM (LJ), KUDOH, OGAWA, and BACTEC 9. Obligatif aerob, 10. Dinding M. tuberculosis sangat kompleks, terdiri dari lapisan lemak cukup tinggi (60%). Penyusun utama dinding sel M. tuberculosis ialah asam mikolat, lilin kompleks complex-waxes), trehalosa dimikolat yang disebut cord factor, dan mycobacterial sulfolipids yang berperan dalam virulensi.
24/02/2010 9

Cont. Karakteristik Mycobacterium tuberculosis 11. Produksi niasin (+) 12. Tidak bersifat endotoksin maupun eksotoksin 13. Replikasinya spectrum luas : bisa dormant 14. Membutuhkan waktu 18 jam untuk menggandakan diri 15. Dapat bertahan hidup pada sputum yang kering 16. Sulit dibedakan gram +/17. Penyebaran : hematogenik 18. Manifestasi klinis tidak spesifik

24/02/2010

10

TB droplet nuclei

12/19/2013

11

KONSENTRAT SPUTUM
Sputum konsentrat : sputum yang telah dihilangkan bahan-bahan lain yang ada di dalamnya dengan tujuan bakteri tahan asam lebih mudah dideteksi
NO
1 2 3

SPUTUM BIASA
LEUKOSIT + BAKTERI LAIN + CARA BKELOMPOK : MENYEBAR (4-5 SEL)

SPUTUM KONSENTRAT
KOLONI (>10 SEL)

24/02/2010

12

KONSENTRAT SPUTUM
Disediakan Sputum penderita batuk khronis Larutan dekontaminan yang terdiri dari campuran: 25 ml NaOH 4%, 25 ml sodium citrate, dan 250 mgr N-Acethyl-L-cystein. Larutan buffer (Phosphat Buffer Saline = PBS) atau aqaudest yang steril Tabung reaksi bertutup sekrup Vorteks Sentrifus
24/02/2010 13

KONSENTRAT SPUTUM
Cara mengerjakan Campurkan sama banyak larutan dekontaminan dengan sputum dalam tabung bertutup sekrup. Vorteks sampai merata selama 10 detik, Biarkan selama 15 menit pada suhu kamar, Lalu encerkan 18 kali dengan phosphat buffer saline atau aqaudest steril. Sentrifus dengan kecepatan 3000 g selama 30 menit pada suhu 4oC, Buang supernatannya dan resuspensikan endapannya dengan 1 ml larutan buf-fer atau aquadest steril, dan campur baik-baik dengan vorteks selama 30 detik bagian supernatan inilah yang dipakai untuk pembuatan preparat atau untuk biakan.
14

24/02/2010

Komposisi Media Lwenstein-Jensen

-asparagin, KH2PO4,Mg sitrat, Mg sulfat, gliserin -putih telur ayam/bebek -malakhit hijau steril 2%

MEDIUM LOWENSTEIN JENSEN

24/02/2010 15

MEDIUM LOWENSTEIN JENSEN

Koloni pada Media Lwenstein-Jensen akan tampak pertumbuhan dalam waktu 34 minggu berwarna putih kekuningkuningan, permukaan kering, kasar (tidak licin) dan rapuh dengan tepi yang tidak beraturan (seperti bunga kol). Tepi : bergerigi

24/02/2010

16

PEWARNAAN GRAM DAN TAHAN ASAM

24/02/2010

17

PEWARNAAN GRAM
Tujuan Melihat bentuk (morfologi ) bakteri Melihat reaksi/sifat pewarnaan Gram dari bakteri. Disediakan 1. Preparat hapus sputum. 2. Biakan bakteri A pd agar miring 3. Biakan bakteri B pd agar miring 4. Satu buah kaca benda 5. NaCl 0,9% steril. 6. Satu set zat warna Gram.

Cara kerja

1. Kaca benda 2 bagi atas A dan B. 2. Buat preparat tipis dan rata bakteri A pd A, dan bakteri B pd bgn B 3. Keringkan dan fiksasi.

Kaca benda 2

Cara kerja
4. Kaca benda/preparat 1 dan 2 mendatar di atas rak preparat, 5. Tuangi kristal violet 1-2 menit.

Cara kerja
6. Buang zat warna, dan bilas 7. Tetesi lugol 30 detik. 8. Buang lugol dan bilas. 9. Lunturkan dgn alkohol 96% dan segera bilas.

Cara kerja
10. Tetesi air fuchsin 2 menit. 11. Buang zat warna dan bilas.

Cara kerja
12. Periksalah di bawah mikroskop 13. Gambarkan apa yang anda lihat ! 14. Buat kesimpulan hasil pewarnaan: - Warna Bakteri positif-Gram - Warna bakteri negatif-Gram - Warna sitoplasma sel - Warna inti sel - Warna latar belakang

Hasil pewarnaan Gram

PEWARNAAN TAHAN ASAM

Tujuan Untuk melihat dan sifat tahan asam dari bakteri. Metode 1. Ziehl-Neelsen 2. Modifikasi Kinjoun (metode Tanzil)

1. Metode Ziehl-Neelsen
Disediakan 1. Preparat hapus dari Sputum penderita 1 yang sudah difiksasi. 2. Satu set bahan bahan pewarnaan Ziehl-Neelsen, yang terdiri dari:

- Larutan karbol fuchsin

- Alkohol Asam - Larutan methylen blue

3. Satu obor kecil yang terdiri dari kapas yang dipintal pada ujung satu kawat.
4. Spiritus

Cara kerja

1. Letakkan preparat mendatar pada rak pewarnaan, 2. Tuangi seluruh kaca benda karbol fuchsin. 3. Panasi zat warna menguap, dinginkan dan panasi lagi. (3 kali dlm 10) 4. Cuci dengan air mengalir.

Cara kerja

5. Lunturkan dengan alkohol asam 3%. Pelunturan dilakukan sampai preparat nampak berwarna merah muda. 6. Segera cuci dengan air mengalir. 7. Beri zat warna kontras, yaitu larutan methylen blue 0,5%, selama 1 menit. 8. Cuci dengan air mengalir.

2. Metode Tanzil (Modifikasi Kinyoun)

Disediakan 1. Sputum penderita 2 2. Satu set bahan untuk pewarnaan modifikasi Kinyoun, yang terdiri dari :
Larutan Kinjoun (Carbol fuchsin) Larutan Gabbet, yang terdiri dari: Methylen blue dan alkohol asam

Cara kerja

1. Letakkan kedua preparat diatas rak pewarnaan 2. Tuangi larutan Kinyoun 3- 5 menit. 3. Buang zat warna dan bilas . 4. Lunturkan dengan alkohol asam semua zat warna larut. 5. Segera bilas, dan keringkan

Cara kerja
6. Tuangi preparat dengan Methylen blue 3 menit. 7. Bilas dan keringkan. 8. Lihat di bawah mikroskop dengan pembesaran emersi , dan gambarkan morfologi serta tuliskan bentuk dan sifat pewarnaan dari sel bakteri serta latar belakang preparat.

12/19/2013

32

Hasil Pewarnaan Tahan Asam

Klebsiella pneumoniae
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Gram negatif yang berbentuk batang (basil). Bersifat non motil fakultatif an aerob memfermentasikan laktosa Indol (-) Dapat mereduksi nitrat banyak ditemukan di mulut, kulit, dan sal usus, namun habitat alami dari Klebsiella pneumonia adalah di tanah 8. Dapat menyebabkan penyakit karena mempunyai dua tipe antigen pada permukaan selnya: Antigen O Antigen O adalah lipopolisakarida yang terdapat dalam sembilan varietas. Antigen K Antigen K adalah polisakarida yang dikelilingi oleh kapsula dengan lebih dari 80 varietas.
24/02/2010 35

24/02/2010

37

TSI (Triple Sugar Iron) Test

Measures capability for gas (clear area) or hydrogen sulfide (H2S black) production from fermentation of the carbohydrates glucose, sucrose, and lactose Red=Alkaline and only glucose fermenter Yellow=Acidic and ferments all three sugars A=Proteus mirabilis B=Salmonella sp. C=E. Coli

SIM (Sulfide Indole Motility) Test

Measures ability to produce H2S (black), Indole from tryptophan metabolism (red), and motility through spreading of inoculum 1=K. pneumoniae 2=E. coli 3=P. vulgaris 4=E. aerogenes

H2S Production in SIM

How to Perform Test: Stab SIM media with inoculating needle. Property it tests for: This test is used to help differentiate
species of the family Enterobacteriaceae. This test is used to determine the ability to reduce sulfur into H2S.

Media and Reagents Used: SIM media contains the sulfur

containing amino acid, cysteine, sodium thiosulfate, & peptonized iron or ferrous sulfate.

Reading Results: H2S will react with the iron or ferrous sulfate
and produce a black precipitate. A positive result has a black precipitate present and a negative result has no black precipitate.

Motility Test
How to Perform Test: Stab motility media with
inoculating needle.

Property it tests for: This test is done to help

differentiate species of bacteria that are motile.

Media and Reagents Used: Motility media

contains tryptose, sodium chloride, agar, and a color indicator.

Reading Results: If bacteria is motile, there will be

growth going out away from the stab line, and test is positive. If bacteria is not motile, there will only be growth along the stab line. A colored indicator can be used to make the results easier to see.

Methyl Red/Voges Proskauer (MR/VP)

How to Perform Tests: Inoculate 2 glucose broths with inoculating loop. After 48 hours of incubation, add a few drops of MR to one tube, and VP reagents to the other tube. Properties they test for: Both tests are used to help differentiate species of the family Enterobacteriaceae. MRtests for acid end products from glucose fermentation. VPtests for acetoin production from glucose fermentation. Media and Reagents Used: Glucose Broth Methyl Red indicator for acid Voges Proskauer reagentsA: 5% Alpha-Naphthol, & ethanol, B: Potassium Hydroxide, & Deionized Water.

MR/VP continued
Reading Results:
MR a + result is red (indicating pH below 6) and a result is yellow (indicating no acid production) VPA + result is red after VP reagents are added (indicating the presence of acetoin) and a result is no color change.

Methyl Red: left and right +

VP: left + and right

Citrate
How to Perform Test: Inoculate slant with inoculating loop. Property it tests for: This test is used to help differentiate
species of the family Enterobacteriaceae. It is selective for bacteria that has the ability to consume citrate as its sole source of carbon and ammonium as sole nitrogen source.

Media and Reagents Used: Simmons Citrate Agar contains

sodium citrate (carbon source), ammonium ion (nitrogen source), & pH indicatorbromthymol blue.

Reading Results:
A + result is blue (meaning the bacteria metabolised citrate and produced an acid end product) and a result remains green

Citrate

Left positive and right negative.

Urea Hydrolysis
How to Perform Test: Inoculate Urea broth with inoculating loop. Property it tests for: This test is done to determine a bacterias ability to hydrolyze urea to make ammonia using the enzyme urease. Media and Reagents Used: Urea broth contains a yeast extract, monopotassium phosphate, disodium phosphate, urea, and phenol red indicator. Reading Results: Urea broth is a yellow-orange color. The enzyme urease will be used to hydrolyze urea to make ammonia. If ammonia is made, the broth turns a bright pink color, and is positive. If test is negative, broth has no color change and no ammonia is made.

Sugar Fermentation Tests

Tube 1: Negative acid /Negative gas Tube 2A: Must incubate longer (ambiguous result) Tube 2B: Positive acid /Negative gas Tube 3A: Positive acid/ Positive gas

Lactose Fermentation
How to Perform Test: Inoculate lactose broth with inoculating
loop.

Property it tests for: This tests for the bacterias ability to

ferment lactose.

Media and Reagents Used: Lactose broth contains beef

extract, gelatin peptone, and lactose. A phenol red indicator is added to indicate acid production from fermentation. Results A positive result is yellow after indicator is added (indicating lactose fermentation) A negative result will have no color change or will be redish.

Sucrose Fermentation
How to Perform Test: Inoculate sucrose broth with inoculating
loop.

Property it tests for: This test is done to help differentiate

species of the family Enterobacteriaceae. This tests for the bacterias ability to ferment sucrose and production of acid endproduct

Media and Reagents Used: Sucrose broth contains beef

extract, gelatin peptone, and sucrose. Phenol red indicator is added to indicate an acid end-product. Results A positive result is yellow after indicator is added (indicating sucrose fermentation) A negative result has no color change or is reddish.

Glucose Fermentation & Gas Production

How to Perform Test: Inoculate broth with inoculating loop. Property it tests for: This test is done to help differnetiate
species of the family Enterobacteriaceae. This tests for the bacterias ability to ferment glucose and produce gas and/or an acid end-product.. Media and Reagents Used: Glucose broth contains beef extract, gelatine peptone, and glucose. A phenol red indicator is added to indicate an acid enproduct. A Durham tube is added to indicate gas production. Results A positive result for acid is yellow after indicator is added (indicating glucose fermentation) A positive result for gas is a bubble in the Durham tube. A completely negative result has no color change or reddish color and no bubble.

Antibiotic Susceptibility Testing

Provide rapid and reliable guidance on antimicrobial chemotherapy Choice of drug is not solely dependent on the result Significant pathogen Pure culture Sensitivity pattern cannot be predicted Rationalisation of the antimicrobial agents stock list

Simple identification with enough antibiotic sensitivity data

KEPEKAAN ANTIBIOTIK
Lakukan pengukuran diameter zona jernih di sekitar disc antibiotik (zona inhibisi) dan bandingkan tabel rujukan untuk menentukan interpretasinya.

SIAP RESPON!!!
24/02/2010 55

TULIS NAMA, NIM, KELOMPOK, ASISTEN

24/02/2010 56

1. Tuliskan karakteristik (min.5) dari : a. Mycobacterium tuberculosis b. Klebsiella pneumoniae

24/02/2010

57

2. a. Sebutkan 4 nama medium untuk mengkultur bakteri Mycobacterium tuberculosis b. Apa komposisi yang terdapat pada medium Lowenstein jensen, dan jelaskan bagaimana penampakan bakteri yang tumbuh pada medium tsb

24/02/2010

58

3. Sebutkan Perbedaan dari sputum biasa dan sputum konsentrat

24/02/2010

59

4. a. Sebutkan reagen yang dibutuhkan untuk pewarnaan tahan asam b. Bagaimana interpretasi pada pewarnaan tahan asam

24/02/2010

60

5. a. Sebutkan contoh bakteri penyebab infeksi saluran pernafasan (min.3) b. Sebutkan tahapan pemeriksaan laboratorium untuk mendiagnosis penyakit infeksi saluran nafas
24/02/2010 61