Petunjuk Praktikum Biokimia II

PETUNJUK PRAKTIKUM
BIOKIMIA II
OLEH : Irma Ratna Kartika, M.Sc.Tech
LABORATORIUM KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA
Petunjuk Praktikum Biokimia II
TATA TERTIB PRAKTIKUM LABORATORIUM KIMIA FMIPA UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA

A. Bila hendak praktikum, praktikkan diwajibkan : 1. Datang tepat waktu. Keterlambatan 15 menit tanpa alasan yang sah dianggap tidak hadir dan tidak diizinkan mengikuti praktikum. 2. Menyiapkan laporan awal, bagan prosedur percobaan dan laporan praktikum. 3. Menyimpan tas pada tempat yang telah disediakan (dibawah meja kerja). 4. Mengisi form kehadiran tiap kali mengikuti praktikum. 5. Membawa alat-alat yang diperlukan selama praktikum berlangsung (handuk kecil, untuk lap, gunting, lem, korek api, sabun cuci tangan). 6. Meminjam dan memeriksa ulang alat kaca yang diperlukan selama praktikum kepada laboran, jika terdapat ketidaklengkapan dan kerusakan, maka praktikan diberikan waktu minimal satu jam untuk menukarnya.
B. Selama praktikum berlangsung, praktikan diwajibkan : 1. Berpakaian sopan dan memakai jas laboratorium. 2. Tidak makan, minum, dan merokok di dalam laboratorium. 3. Tidak bercanda dan bertindak yang dapat menimbulkan kecelakaan terhadap orang lain. 4. Tidak mereaksikan sembarang bahan kimia tanpa ada petunjuk praktikum yang jelas dan tanpa seizing dosen dan asisten dosen. 5. Tidak membuang sampah atau bahan sisa percobaan kedalam wastafel. i
Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ
6. Menjaga kebersihan, ketertiban, dan keamanan laboratorium secara bersama.
C. Setelah praktikum selesai, praktikan diwajibkan : 1. Mencuci dan membersihkan semua alat kaca yang digunakan selama praktikum dengan sabun cair/tepol yang telah disediakan. 2. Memeriksa kembali kelengkapan dan keutuhan alat yang dipinjam kemudian mengembalikannya kepada laboran. 3. Memberihkan meja praktikum masing-masing tanpa mengandalkan mahasiswa yang piket. 4. Lapor diri apabila selama praktikum memecahkan alat kaca. 5. Menyerahkan data/laporan sementara kepada asisten dosen untuk di paraf oleh dosen pembimbing. 6. Meninggalkan laboratorium dengan seizin dosen pembimbing atau asisten dosen.
Jakarta, Januari 2013 Kepala Laboratorium Kimia
Drs. Zulhipri, M.Si. NIP. 19580703 198903 1 001
ii
DAFTAR ISI
TATA TERTIB PRAKTIKUM DAFTAR ISI I. UJI KUANTITATIF KARBOHIDRAT A. B. Penentuan Gula Pereduksi dengan Metode Somogyi-Nelson Penentuan Karbohidrat dengan Metode Anthrone
i iii 1 2 2
II. UJI KUANTITATIF PROTEIN A. B. Penentuan Protein dengan Metode Lowry Penentuan Protein dengan Metode Biuret
4 5 5
III. UJI KUANTITATIF LIPID A. B. C. D. Penentuan Angka Asam Penentuan Angka Iodium Penentuan Angka Peroksida Penentuan bilangan TBA (Asam Tiobarbiturat)
7 7 8 9 9 11 11 12 14 14 15 16 19
IV. DARAH A. Penentuan Kolesterol dalam Darah B. Penentuan Glukosa dalam Darah V. URINE A. Penentuan Sifat Fisik dari Urine B. Penentuan Beberapa Komponen yang Terdapat dalam Urine C. Penentuan Beberapa Senyawa pada Urine tidak Normal VI. ELEKTROFORESIS GEL POLIAKRILAMID-SDS
iii
UJI KUANTITATIF KARBOHIDRAT
I.
TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi karbohidrat. 2. Mahasiswa dapat membandingkan metode Somogyi-Nelson dan metode Anthrone.
II.
TEORI SINGKAT
Pada percobaan ini digunakan metode penentuan gula pereduksi
dengan metode Somogyi-Nelson, dimana gula pereduksi bila dipanaskan dengan larutan tembaga tartrat yang bersifat basa akan menghasilkan tembaga oksida (Cu2O). Tembaga oksida ini akan bereaksi dengan larutan arsenomolibdat menghasilkan warna biru molibdenum dan intensitas warnanya diukur dengan spektrofotometer. Pada penentuan ini perlu ditambahkan natrium sulfat ke dalam larutan yang berwarna biru untuk mencegah oksigen dari udara yang dapat mengoksidasi kembali Cu2O. Penentuan ini tidak dapat digunakan untuk campuran gula-gula pereduksi. Selain itu protein perlu dipisahkan terlebih dahulu dengan menambahkan Zn(OH)2 sebagai pengendap protein. Reaksi anthrone merupakan metode yang baik dan cepat untuk menentukan heksosa, aldopentosa, dan asam heksuronat, juga untuk mengetahui adanya polisakarida. Larutan yang berwarna kehijauan ini memiliki absorpsi maksimum 620nm, namun beberapa karbohidrat dapat memberikan warna lain. Reaksi tidak sesuai jika terdapat protein yang mengandung banyak gugus triptofan, karena akan memberikan warna merah. 1
III.
PROSEDUR KERJA
A. Penentuan Gula Pereduksi dengan Metode Somogyi-Nelson 1. Pipet 0,1 mL larutan standar gula pereduksi yang mengandung 50 250 g/mL, masukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 1,5 mL air kemudian aduk sampai homogen. 2. Pindahkan campuran ke dalam tabung reaksi yang berisi 1 mL pereaksi Ba(OH)2 0,3 M dan 0,2 mL larutan ZnSO4. Kemudian kocok dan sentrifugasi selama beberapa menit. 3. Pindahkan 1 mL supernatan ke dalam tabung reaksi lain selanjutnya tambahkan 1 mL pereaksi Somogyi-Nelson (tembaga alkali). 4. Pasang penutup pada tabung, kemudian panaskan tabung di dalam penangas air selama 15 menit. 5. Dinginkan tabung dan tambahkan 1 mL pereaksi arsenomolibdat. Biarkan larutan beberapa saat sampai tidak timbul gelembunggelembung udara. 6. Encerkan larutan yang berwarna biru hingga volume 10 mL dan ukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm. 7. Sampel dan blanko diperlakukan sama dengan larutan standar (prosedur dimulai dari nomor 1 6). 8. Hitung kadar gula pereduksi yang didapat dari kurva absorbansi vs konsentrasi standar. B. Penentuan Karbohidrat dengan Metode Anthrone 1. Tambahkan 4 ml reagen anthrone (0,2 % anthrone dalam H2SO4 pekat) kedalam 1 ml larutan karbohidrat (yang tidak mengandung protein) kocok dengan cepat (awas asam kuat). 2. Letakkan tabung-tabung tersebut diatas penangas air yang sedang mendidih tutup mulut tabung dengan kelereng untuk mengurangi penguapan larutan tersebut. 3. Dinginkan dan setelah 20 menit, ukur absorbansinya pada panjang gelombang 620 nm. Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ 2
4. Larutan standar dan blanko diperlakukan sama dengan sampel (prosedur dimulai dari nomor 1 3). 5. Hitung kadar karbohidrat yang didapat dari kurva absorbansi vs konsentrasi standar. 6. Konsentrasi karbohidrat standar yang dibuat adalah 5, 10, 15, 20 dan 25 mg/100mL. IV. PUSTAKA Harrow, B., et al. 1960. Laboratory Manual of Biochemistry, 5th ed., W. B. Sanders Comp., New York, 1-4. Frais, F. 1971. Practical Biochemistry in Introductory Course , 1st ed., Butterworth & Co., Ltd., London, 23-25. Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005. Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005. Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.
UJI KUANTITATIF PROTEIN
I.
TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi protein. 2. Mahasiswa dapat membandingkan metode Lowry dan metode
Biuret.
II.
TEORI SINGKAT
Penentuan konsentrasi protein merupakan proses yang rutin
digunakan dalam kerja Biokimia. Ada beberapa metode yang biasa digunakan dalam rangka penentuan konsentrasi protein, yaitu metode Biuret, Lowry, dan Bradford. Masing-masing metode mempunyai
kekurangan dan kelebihan. Pemilihan metode yang terbaik untuk suatu pengukuran bergantung pada beberapa faktor misalnya; banyaknya material atau sampel yang tersedia, waktu yang tersedia untuk melakukan pengukuran, alat spektrofotometri yang tersedia (VIS atau UV) dan lain sebagainya. Prinsip metode Lowry adalah mempertajam warna yang dihasilkan pada metode Biuret. Pada metode ini, setelah protein direaksikan dengan pereaksi Biuret, ditambahkan pereaksi fosfomolibdat-fosfotungstat. Pada reaksi lanjutan ini akan terjadi reaksi oksidasi-reduksi dengan gugus tirosin dan triptofan yang ada pada protein. Batas deteksi untuk metoda ini adalah 20-200 g protein.
II.
PROSEDUR KERJA
A. Penentuan Protein dengan Metode Lowry 1. Sediakan alat-alat gelas dan ikuti prosedur seperti tabel dibawah ini. Blanko Standar 1 2 3 4 5 6 BSA 400 ppm (mL) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Sampel (mL) H2O (mL) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Pereaksi Lowry (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 Kocok, diamkan 10 menit dan langsung ditambahkan Folin-Ciocalteu 1 N (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Zat Sampel 7 8 0,2 0,4 0,3 0,1 5,0 5,0 0,5 0,5
2. Inkubasi semua larutan pada suhu kamar selama 30 menit, baca absorbansinya pada = 700 nm. Waktu inkubasi ini dapat dimulai (start) setelah penambahan/pencampuran reagen Folin-Ciocalteu ke dalam tabung terakhir. 3. Konsentrasi sampel dihitung dari kurva absorbansi vs. konsentrasi standar. B. Penentuan Protein dengan Metode Biuret 1. Sediakan alat-alat gelas dan ikuti prosedur seperti tabel dibawah ini. Zat BSA 10 mg/mL (mL) Sampel (mL) H2O (mL) Pereaksi Biuret (mL) Blanko 1 2 8 2 0,2 1,8 8 3 0,6 1,4 8 Standar 4 1 1 8 5 1,4 0,6 8 6 1,8 0,2 8 Sampel 7 8 ? ? ? ? 8 8
2. Kocok semua larutan, diamkan pada suhu kamar selama 30 menit dan baca absorbansinya pada = 550 nm. 3. Konsentrasi protein dalam sampel dihitung dari kurva absorbansi vs. konsentrasi standar. 5
Pertanyaan: 1. Apakah kelebihan dan kelemahan kedua metode tersebut diatas? 2. Jelaskan sedikitnya dua metode lain (secara spektrofotometri) dalam menentukan konsentrasi protein berikut kelebihan dan kekurangannya dibandingkan dengan kedua metode diatas.
IV. TUGAS PENDAHULUAN

1. Mengapa metode Lowry lebih peka dibandingkan Biuret dalam menganalisa protein? 2. Beri penjelasan mengenai metode lain untuk menentukan konsentrasi protein berikut kelebihan dan kekurangannya
IV. PUSTAKA
Colowick, S. P. dan Kaplan, N. O. 1957. Methods in Enzymology, Vol. V, Acad. Press Inc., New York, halaman 448-450. Holme, D. J. dan Peck, H. 1993. Analytical Biochemistry, 2nd ed., Longman Scientific and Technical, New York. Alexander, R. R. dan Griffiths, J. M. 1993. Basic Biochemical Methods, 2nd ed., A. John Wiley & Sons, Inc., New York.
UJI KUANTITATIF LIPID
I.
TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi lipid. 2. Mahasiswa dapat membandingkan berbagai metode penentuan
lipid
II.
TEORI SINGKAT
Lipid merupakan komponen jaringan yang heterogen dan
penggolongannya didasarkan atas kelarutannya di dalam pelarut-palarut lemak, seperti eter dan lain-lain. Sedangkan komponen-kompnen campuran lipid dapat difraksinasi lebih lanjut dengan menggunakan perbedaan kelarutannya di dalam berbagai pelarut organik. Sebagai contoh; fosfolipid dapat dipisahkan dari sterol dan lemak netral atas dasar ketidak larutannya di dalam aseton.
III. PROSEDUR KERJA

A. Penentuan Angka Asam Selama disimpan, minyak atau lemak dapat menjadi tengik karena adanya asam lemak bebas dan senyawa aldehid sebagai akibat terjadinya pemutusan ikatan rangkap melalui pembentukan peroksida oleh oksidasi udara atau hidrolisis oleh mikroorganisme. Jumlah asam lemak bebas yang terdapat dalam minyak dapat menunjukkan umur penyimpanan dan kualitas minyak tersebut. Angka asam adalah jumlah mg KOH yang dibutuhkan untuk menetralkan asam lemak bebas yang terdapat dalam 1 g lemak atau minyak. 7
Prosedur: Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ
1. Larutkan 10 g sampel dalam 50 mL alkohol secara kuantitatif, kemudian tambahkan indikator phenolphthalein. 2. Titrasi campuran dengan larutan NaOH 0,1 N sampai timbul warna merah jambu yang tidak hilang selama 30 detik. Lakukan hal yang sama pada blanko. 3. Hitung angka asarn sampel. B. Penentuan Angka Iodium Angka iodium adalah jumlah mg iodium yang diserap oleh 1 g minyak atau lemak. Angka iodium dapat menunjukkan indikasi seberapa banyak asam lemak tidak jenuh yang terdapat dalam minyak atau lemak. Asam lemak tidak jenuh dapat mengalami reaksi adisi dengan halogen pada ikatan rangkapnya. lodin monoklorida bereaksi dengan ikatan rangkap dan jumlah iodium yang bereaksi dapat ditentukan dengan cara mentitrasi iodium yang sisa dengan dengan larutan standar tiosulfat, setelah terlebih dahulu ditambah KI.
Prosedur: 1. Timbang 0,5 g sampel dalam erlenmeyer tertutup dan larutkan dalam 10 mL kloroform. 2. Tambahkan 10 mL larutan Hannus/Wijs secara kuantitatif ke dalamnya dan diamkan selama 30 menit di tempat gelap. 3. Tambah 10 mL larutan KI 15% lalu kocok. 4. Semprot dinding erlenmeyer dan tutupnya dengan air didih. 5. Titrasi campuran dengan larutan natrium tiosulfat 0,1 N sampai larutan berwarna kuning. 6. Tambahkan 1 mL larutan kanji, selanjutnya titrasi kembali sampai 8
warna biru hilang. Lakukan percobaan yang sama untuk blanko. 7. Hitung angka iodium sampel.
C. Penentuan Angka Peroksida Lipid mudah mengalami oksidasi sehingga menyebabkan tengik. Lipid bila teroksidasi akan menghasilkan senyawa hidroperoksida. Untuk mengetahui banyaknya lipid yang teroksidasi ditentukan dengan bilangan peroksida. Ada beberapa cara untuk penentuan ini. Prosedur: 1. Masukkan 100 mg sampel ke tabung reaksi, tambahkan 0,5 mL larutan KI, larutan AlCl3 0,5 mL dan 1 mL n-heksana. 2. Inkubasi campuran pada 37C selama 5 menit. 3. Tambahkan 15 mL larutan HCl 0,01 N dan 0,5 mL larutan kanji. Kocok campuran dengan kuat dengan menggunakan corong pisah. Pisahkan lapisan bawah dan baca absorbansinya pada = 560 nm. 4. Lakukan kalibrasi menggunakan larutan standar KIO 3 dengan cara mencampurkan 0,2 mL larutan KIO 3, 0,5 mL larutan AICl 3 dan 0,5 mL larutan KI lalu tambahkan 15 mL larutan HCl 0,01 N dan 0,5 mL larutan kanji dan diukur absorbansinya pada = 560 nm.
Angka proksida 1,2 x A x K m x A st
Dengan: A Ast m K = = = = absorbansi sampel pada = 560 nm absorbansi standar pada = 560 nm berat minyak (g) faktor konversi volume (1,01212)
D. Penentuan bilangan TBA (Asam Tiobarbiturat) Hidroperoksida yang merupakan hasil utama pada reaksi oksidasi lipid dapat mengalami penguraian menjadi senyawa yang lebih kecil seperti aldehida. Aldehida dapat menimbulkan bau dan rasa tidak enak pada lipid. Selain itu aldehida dapat bersifat karsinogenik. Untuk mengetahui banyaknya aldehida dapat digunakan metode TBA, Sebagai contoh reaksi antara malonaldehida dengan TBA. 9
Prosedur: 1. Timbang 0,2 g minyak dan 1 mL heksana. Kocok campuran. 2. Pipet 0,5 mL campuran, tambahkan 4 mL larutan TCA 20% dan 2 mL larutan asam tiobarbiturat 0,67%. 3. Tambahkan 1 mL kloroform ke dalam campuran, kocok dan pisahkan dengan corong pisah. Ukur absorbansi larutan yang berwarna merah jernih pada = 531.5 nm. IV. PUSTAKA Frais, F. 1972. Practical Biochemistry in Introductory Course , 1st ed., Butterworth & Co., Ltd., London, 104. Harrow, B., et al. 1960. Laboratory Manual of Biochemistry, 5th ed., W. B. Sanders Comp., New York, 13-17. Petunjuk Praktikum Biokimia Dasar Institut Teknologi Bandung 2005. Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Indonesia 2005. Petunjuk Praktikum Biokimia Universitas Negeri Jakarta 2005.
10
DARAH
I.
TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengidentifikasi kolesterol dalam darah. 2. Mahasiswa dapat menentukan kadar glukosa dalam darah.
II.
TEORI SINGKAT
Kolesterol termasuk senyawa lipid kelompok steroid, bisa terdapat
bersama lemak hewan, tidak terdapat bersama lemak tumbuhan. Kolesterol terdapat pada seluruh tubuh, terutama pada jaringan syaraf, baik pada sistem syaraf pusat maupun sistem syaraf tepi (perifer), juga terdapat pada anak ginjal, plasma darah dan lemak kulit. Hablur kolesterol berbentuk persegi panjang dan sukar larut dalam air, keberadaannya dalam serum berkonjugasi sebagai lipoprotein 25% kolesterol dan 75% ester asam lemak tak jenuh. Pemeriksaan kolesterol secara klinis dapat dipergunakan untuk menganalisis metabolisme tubuh. Kadar kolestrol dalam serum bergantung pada usia, jenis kelamin, pola hidup, pola makanan, keseimbangan hormonal dan kehamilan. Kadar kolesterol normal dalam darah adalah 140 250 mg/100 mL. Dalam lingkungan asam, kolesterol bereaksi dengan asam menjadi senyawa yang tidak stabil dan memberikan warna yang intensif, sehingga berguna untuk identifikasi.
III. PROSEDUR KERJA

A. Penentuan Kolesterol dalam Darah a. Pembuatan Filtrat Darah Bebas Protein 1. Diambil 0,1 mL darah yang oxalated, dimasukkan dalam tabung sentrifuse yang telah berisi 1,9 mL aquades, dicampur hingga homogen. Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ 11
2. Ditambahkan 1,5 mL Ba(OH)2 0,3 M, diaduk hingga homogen. 3. Ditambahkan lagi kedalamnya 1,5 mL ZnSO4 5 %. 4. Semua campuran dihomogenkan dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse selama 20 menit. 5. Filtrat bening hasil sentrifuse akan digunakan untuk menentukan kadar kolesterol dalam darah. b. Penentuan Kolestrol dalam Darah (500 nm) 1. Serum darah sebanyak 1 mL dimasukkan kedalam tabung sentrifuse kemudian ditambahkan 1 mL kloroform, kocok dan sentrifuse selama 5 menit. 2. Ambil supermatannya dan pindahkan ke tabung reaksi, kemudian tambahkan 0,5 mL asam asetat anhidrida dan 3 tetes asam sulfat pekat. 3. Kocok hati-hati dan periksa warna yang terbentuk. 4. Warna yang terbentuk tidak stabil dari warna merah berubah ke biru dan hijau. 5. Ukur absorbansinya pada panjang gelombang 430 nm dan 560 nm. 6. Kadar kolesterol darah diukur dari kurva absorbansi vs konsentrasi kolesterol standar.
c. Pertanyaan 1. Mengapa terjadi perubahan warna tidak stabil pada supernatan yang dihasilkan? 2. Berapakah kadar kolesterol dalam darah secara semikuantitaf? 3. Apakah kesimpulan percobaan anda? B. Penentuan Glukosa dalam Darah Salah satu cara penentuan kadar glukosa darah dapat dilakukan dengan metode kondensasi gugus amin. Prinsipnya adalah aldosa dikondensasi dengan o-toluidin dalam suasana asam dan menghasilkan 12
larutan berwarna hijau setelah dipanaskan. Kadar glukosa ditentukan dengan membandingkan warna yang terjadi hasil spektrofotometer dengan larutan standar glukosa yang telah ditentukan konsentrasinya. Prosedur: 1. Diambil 0,1 mL darah yang oxalated, dimasuk kan dalam tabung sentrifuse yang telah berisi 1 mL TCA kemudian disentrifuse selama 5 menit. 2. Sebanyak 0,5 mL serum darah diambil dan ditambahkan 2 mL otoluidin lalu dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 8 menit. Kemudian didinginkan dengan air mengalir. 3. Setelah 20 menit, ukur absorbansinya pada panjang gelombang 630 nm. 4. Kadar glukosa darah diukur dari kurva absorbansi vs konsentrasi glukosa standar. 5. Konsentrasi glukosa standar yang dibuat adalah 5, 10, 15, 20 dan 25 mg/100mL.
13
URINE
I.
TUJUAN
Mahasiswa mengetahui berbagai uji kualitatif urine.
II.
TEORI SINGKAT
Urine merupakan cairan yang diekskresikan oleh ginjal. Komponen dan
kadar dari zat-zat yang terdapat dalam urine berbeda-beda tergantung dari apa yang dimakan dan apa yang tidak dibutuhkan oleh tubuh. Bagian yang tidak dibutuhkan tersebut akan dikeluarkan oleh tubuh. Selain air, urine mengandung garam-garam, asam, basa, sisa-sisa metabolisme yang tidak dibutuhkan lagi oleh tubuh, zat hasil detoksifikasi dan kelebihan zat yang dikeluarkan oleh darah. Untuk mengetahui apakah fungsi organ tubuh normal atau tidak dapat dilakukan percobaan terhadap urine.
III. PROSEDUR KERJA

A. Penentuan Sifat Fisik dari Urine Prosedur: 1. Kumpulkan urine selama 24 jam dan beri pengawet. Sebagai pengawet dapat dipakai 40%. 2. Lakukan penentuan-penentuan sebagai berikut: 2 mL toluene atau 2 mL formaldehida
a. Penentuan volume urine Setelah ditampung selama 24 jam, tentukan volume urine kemudian kocok urine tersebut sarnpai homogen. Pisahkan sebanyak 250 mL untuk pemeriksaan di laboratorium. 14
b. Penentuan kejernihan dan warna Amati warna urine dan kejernihannya. c. Penentuan pH urine Tentukan pH urine menggunakan kertas pH universal.
B. Penentuan Beberapa Komponen yang Terdapat dalam Urine a. Penentuan garam-garam ammonium 1. Tempatkan 2 mL urine ke dalam tabung reaksi. 2. Tambahkan larutan NaOH encer sampai larutan bersifat basa (gunakan kertas lakmus merah). 3. Panaskan campuran di penangas air. 4. Cium bau uap yang keluar dan uji uap tersebut dengan kertas lakmus merah basah.
b. Pemeriksaan sulfat anorganik dan sulfat eterial 1. Tempatkan 5 mL urine dalam tabung reaksi. 2. Asamkan dengan 1 mL larutan HCl 0,5 M. 3. Tambahkan 1 mL larutan BaCl 2 1 M, kocok dan saring endapan yang terbentuk. 4. Pisahkan fiitrat dan endapannya. 5. Larutkan endapan dalam 1 mL HCl 0,5 N dan amati perubahan yang terjadi. 6. Didihkan filtrat di penangas air, bila tidak ada endapan, tambahkan lagi 1 mL larutan BaCl 2 1 M. Bila timbul kekeruhan rnenunjukkan adanya sulfat eterial.
c. Penentuan asam urat Tes ini dinamakan juga tes mureksid. Asam urat bila dioksidasikan oleh asam nitrat akan menghasilkan asam dialurat dan alloksan, yang akan mengalami kondensasi dengan adanya NH 3. Hasil kondensasi ini 15
dinamakan mureksid atau ammonium purpurat yang berwarna ungu kemerahan. Prosedur: 1. Tempatkan 2 mL urine dalam cawan penguap. 2. Tambahkan 4 tetes HNO3 pekat dan panaskan di atas hot plate dalam lemari asam sampai airnya menguap. 3. Amati warna yang terbentuk pada endapan dan tambahkan 2 mL larutan NH3 1:100. 4. Amati perubahan warna yang terjadi.
d. Penentuan kreatinin Percobaan ini berdasarkan pembentukan warna merah rubi bila kreatinin direaksikan dengan nitroprusida dalam suasana basa. Warna tersebut lama kelamaan berubah menjadi kuning. Bila campuran tersebut diasamkan dengan asam asetat, warnanya akan berubah menjadi hijau dan kemudian menjadi biru karena terbentuknya biru prusian. Prosedur: 1. Tempatkan 5 mL urine dalam tabung reaksi dan tambahkan 5 tetes larutan natrium nitroprusida 0,1 M. 2. Teteskan larutan NaOH 1 M tetes demi tetes sampai warna merah timbul. 3. Didihkan campuran tersebut dan amati perubahan warna yang terjadi. 4. Asamkan dengan asam asetat glasial dengan hati-hati, panaskan dan amati perubahan warna yang terjadi. C. Penentuan Beberapa Senyawa pada Urine tidak Normal Yang dimaksud dengan urine tidak normal adalah urine dengan kadar senyawa-senyawa tertentu di atas batas ambang normal. Senyawa 16
tersebut bila dalam keadaan normal tidak terdeteksi, tetapi pada keadaan tidak normal (penderita), senyawa tersebut akan terdeteksi. a. Penentuan adanya glukosa yang berlebih Glukosa pada penderita diabetes kadarnya dalam darah berlebih dan dikeluarkan melalui urine. Adanya glukosa sebagai gula pereduksi dapat dideteksi dengan pereaksi Benedict. 1. Teteskan 5 tetes urine tidak normal ke dalam tabung reaksi. 2. Tambahkan 1 mL larutan Benedict dan didihkan selama 5 menit di penangas air 3. Amati perubahan yang terjadi.
b. Penentuan benda-benda keton Benda-benda keton merupakan senyawa-senyawa yang terbentuk akibat metabolisme yang tidak sempurna. Benda-benda keton terdiri dari aseton, 6-hidroksibutirat dan asetoasetat. Terbentuknya benda keton dapat menyebabkan terjadinya asidosis. Benda-benda keton ini dapat dikeluarkan melalui urine. Prosedur: 1. Tempatkan 1 mL urine tidak normal dalam tabung reaksi. 2. Jenuhkan dengan larutan (NH4)2SO4 jenuh sambil dikocok. 3. Tambahkan 2 tetes larutan natrium nitroprusida 5% (fresh/baru dibuat) dan 1 mL NH3 pekat. 4. Kocok dan biarkan selama 30 menit. Warna ungu yang timbul menandakan adanya keton.
c. Penentuan darah Darah kadang-kadang ada dalam urine, terutama bila ada infeksi atau luka pada saluran urine dan luka pada ginjal. Prosedur: 1. Tempatkan 2 rnL urine tidak normal dalam tabung reaksi. 17
2. Tambahkan 1 mL larutan Benzidin jenuh dan 3,5 mL larutan H2O2 3%. 3. Kocok campuran dan amati perubahan yang terjadi.
18
ELEKTROFORESIS GEL POLIAKRILAMID-SDS
I.
TUJUAN
1. Mahasiswa mengetahui dan mempergunakan alat elektroforesis 2. Mahasiswa dapat menentukan berat molekul protein.
II.
TEORI SINGKAT
Protein adalah suatu polimer yang monomernya terdiri asam amino yang
terikat oleh ikatan peptide. Suatu protein aktif merupakan suatu polipeptida yang telah melipat membentuk struktur tersier dan kuarterner. Protein tertentu mempunyai susunan dan jumlah asam amino tertentu. Dengan kata lain protein mempunyai berat molekul tertentu dan biasanya dinyatakan dengan susunan Da. Satu molekul asam amino mempunyai berat molekul 110 Da. Berat molekul satu protein dapat ditentukan dengan berbagai macam cara, salah satunya adalah dengan elektroforesis sodiumdodecyl sulfate-polycrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Metode SDS-PAGE juga dapat digunakan untuk menetukan apakah suatu protein terdiri dari satu submit atau lebih. Metode SDS-PAGE adalah pemisahan protein didasarkan pada perbedaan berat molekul protein dalam suatu medan listrki. SDS adalah suatu detergen yang bermuatan negatif yang akan membentuk kompleks dengan molekul protein. Dengan demikian protein akan bermuatan negatif dengan muatan yang sebanding dengan panjang rantai subunit. SDS mengikat bagian hidrofobik dari protein dan merusak struktur sekunder, tersier dan kuarterner protein. Gel polikarilamid adalah media pendukung yang dipakai untuk memisahkan protein. Gel ini merupakan hasil polimerisasi dari akrilamid dengan menggunakan N, Nmetilen-bis-akrilamid sebagai pembentuk ikatan silang. Molekul protein akan bermigrasi melewati pori gel akrilamid dengan mobilitas yang tergantung pada panjangnya. Jika suatu protein mengandung lebih dari satu submit maka pada elektroforesis akan terdapat lebih dari dua molekul yang bermigrasi. Berat molekul protein dapat ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi antara logaritma berat molekul protein standar dan jarak migrasi.
19
Teknik elektroforesis SDS-PAGE ini juga dapat digunakan untuk berbagai keperluan, misaknya: penentuan kemurnian protein, penentuan konsentrasi protein, penentuan adanya proteolisis dan deteksi adanya modifikasi pada protein.
III. PROSEDUR KERJA

Alat: 1) Bio-Rad Mini-Protean II. 2) Power supply. 3) Tabung Eppendorf. 4) Gel loading tips. Bahan: 1) Akrilamid : bis-akrilamid (39:1) 2) Tris-HCl pH 6.8 1M 3) Tris-HCl pH 8,7 1M. 4) SDS 20%. 5) N,N,N,N-tetrametiletilendiamin (TEMED). 6) Ammonium persulfat 10%. 7) Running Buffer (1g SDS, 3,03 g Tris, 14,4 g glisin, ditambahkan air sampai dengan 100 mL). 8) Larutan staining (40 mL metanol, 15 mL asam asetat, 0,1 g Coomassie brilliant blue G250, ditambahkan air sampai dengan 100 mL). 9) Larutan destaining (10 mL metanol, 7,5 mL asam asetat, ditambahkan air sampai dengan 100 mL). 10) 5x Sampel Buffer (12,5 mL 1M Tris pH 6,8; 20 mL gliserol, 10 mL mercaptoethanol, 40 mL 10% SDS, 15 mg Bromophenol Blue). 20
Tabel Komposisi Gel Poliakrilamid 10% Larutan Induk Acr/Bis H2O 1 M Tris pH 6,8 1 M Tris pH 8,7 20% SDS 10% APS TEMED (l) Stacking Gel (mL) 2, 5 14,84 2,5 0,1 0,1 16 Running Gel (mL) 10 13 15 0,2 0,2 30
PERHATIAN!!! Akrilamid adalah senyawa neurotoxin, Jadi gunakan sarung tangan kalau membuat gel akrilamid. Polimer akrilamid tidak bersifat neurotoxin. Jangan menyentuh alat elektroforesis yang sedang ada voltase. Cara Kerja: A. Persiapan Gel 1. Campurkan semua larutan untuk separating gel dengan urutan penambahan sesuai dengan tabel diatas. 2. Tuangkan (dengan menggunakan pipet) larutan ke dalam gel sandwich sampai kira-kira 1,5 cm dari bagian atas plate. 3. Tambahkan air sampai ketinggian kira-kira 1-5 mm. 4. Diamkan sampai terjadi polimerisasi (30 menit). 5. Campurkan semua larutan untuk stacking gel dengan urutan penambahan sesuai dengan tabel di atas. 6. Buang air yang terdapat pada bagian atas separating gel. 7. Tuangkan campuran stacking gel di atas separating gel dan siapkan comb. 8. Diamkan sampai terjadi polimerisasi (30 menit).
B. Persiapan Sampel 1. Siapkan larutan protein standard an sampel protein. 2. Tambahkan larutan 5x sampel buffer.
21
3. Didihkan selama 5 menit.
C. Elektrolisis Gel 1. Pasangkan gel sandwich yang telah disiapkan ke alat
elektroforesis. 2. Tuangkan running buffer kedalam tank elektroforesis. 3. Masukan sampel protein (10-20 g) ke dalam tiap-tiap lubang gel dengan pipet mikro (Eppendorf). 4. Pasang penutup alat elektroforesis. 5. Sambungkan ke power supply dan lakukan elektroforesis pada voltase tetap 200 V. 6. Matikan alat setelah blue dye tepat keluar dari gel (kira-kira 60 menit).
D. Staining dan Destaining 1. Keluarkan gel dari plate (gunakanlah sarung tangan). 2. Masukan kedalam larutan destaining (50 mL). 3. Biarkan selama 15 menit. 4. Pindahkan kedalam larutan destaining (50 mL). 5. Biarkan sampai gel menjadi bersih (30 menit-semalam). Tugas: 1. Buat kurva kalibrasi protein standar. 2. Tentukan berat molekul protein sampel yang dianalisis.
IV. TUGAS PENDAHULUAN

1. Jelaskan reaksi pembentukan polimer poliakrilamid dan sebutkan fungsi bis-akrilamid, TEMED, ammonium persulfat dan 22 memvisualisasikan protein hasil
merkaptoetanol. 2. Jelaskan prinsip elektroforesis. 3. Jelaskan bagaimana cara
pemisahan dengan SDS-PAGE. Laboratorium Kimia | FMIPA - UNJ
V. PUSTAKA Bollag, D. M., Rozycki, M. D. and Edelstein, S. J. 1996, Protein Methods, 2nd ed., A John Willey & Sons, Inc. Pub, New York. Boyer, R. F. 1993, Modern Experimental Biochemistry, 2nd ed., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. California. Matthew, C. K. and van Holde, K. E. 1991, Biochemistry, The Benjamin/Cummnings Publishing Company, Inc. California.
23

Petunjuk Praktikum Biokimia II

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Petunjuk Praktikum Biokimia II

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

PETUNJUK PRAKTIKUM

OLEH : Irma Ratna Kartika, M.Sc.Tech