CaraPengawetandanPenyimpanan

BiakanFungi
Marlia Singgih Wibowo
School of Pharmacy
Institut Teknologi Bandung
Outline
Prinsip Umum
Teknik Pengawetan (Preservation)
Keuntungan dan Kerugian
Pemilihan Metode
PrinsipUmum
Tujuan utama
memelihara biakan
suatu fungus adalah
untuk menjaga galur
fungus tersebut di
dalam suatu media
tanpa terjadi nya
perubahan morfologi,
fisiologi, atau genetik
PrinsipUmum
Organisme dapat
berasal dari
berbagai sumber
Contoh :
Penicillium
digitatum
PrinsipUmum
Teknik pengawetan sangat bervariasi, dapat
dengan mengurangi kecepatan metabolisme
atau bahkan dapat menunda metabolisme
mikroorganisme
Pengawetan yang baik bila digunakan biakan
yang sehat dan kondisi pertumbuhan yang
optimum
Microorganisme tumbuh dalam lingkungan dan
kondisi yang berbeda-beda
Beberapa diantaranya memiliki spesifisitas
tertentu sebagai syarat pertumbuhannya
PrinsipUmum
Umumnya
Mikroorganisme
tumbuh baik dalam
media yang dibuat
mendekati kondisi
lingkungan tempat
asalnya
Contoh : tanah,
bagian tanaman atau
komponen air, dll.
PertumbuhanMikroorganisme
Media pertumbuhan dapat bervariasi.
Misalnya Raper & Thom (1949)
menggunakan Czapek's Agar, Steep Agar
and Malt Extract Agar untuk pertumbuhan
Penicillia dan Aspergilli
Pitt (1980) menganjurkan penggunaan
recommends Czapek Yeast Autolysate (CYA)
dan Malt Extract Agar (MEA) untuk penicillia
Standarisasi of formula media penting
dilakukan
Media akan mempengaruhi morfologi dan
warna koloni, karena kandungan media akan
mempengaruhi pembentukan senyawa
tertentu atau menginduksi sifat tertentu dari
mikroorganisme
Pertumbuhan
Pengaruh Media terhadap morfologi koloni
Kontaminasipadakulturfungi
Biakan Fungi sering terkontaminasi oleh
Tyroglyphus or Tarsonemus
Di alam banyak terdapat pada tanah, dan
hampir semua bahan organik
Terbawa ke laboratorium dari bahan
tanaman, produk yang sudah kadaluarsa,
pada sepatu, serangga atau biakan
mikroorganisme lain.
Cepat berkembang biak dalam keadaan
lembab dan suhu ruang
Biakan fungi menjadi rusak dan tidak dapat di
simpan
PencegahanKontaminasi
Melakukan pekerjaan sesuai prosedur
Menjaga kebersihan dan kesehatan diri
Selalu memeriksa setiap barang yang masuk ke laboratorium
Menutup setiap biakan atau barang yang digunakan sesuai prosedur
Metodepencegahankontaminasi
Hygiene
Bersihkan seluruh permukaan dan hindari
biakan dari udara luar dan debu
Cuci peralatan dengan desinfektan yang
sesuai.
Fumigation
Digunakan selang waktu tertentu untuk ruang
laboratoriumatau korikor. Pekerjaan ini harus
dilakukan oleh yang berwenang
Mechanical and chemical barriers
Universal bottles, kapas lemak, tube
bersumbat
Metodepencegahankontaminasi
Tempat penyimpanan yang aman
Lemari pendingin 4-8C
Lemari penyimpanan deep freeze (<-
20C)
Menutup kultur dengan minyak mineral
Simpan dengan silica gel
Freeze-dry
Simpan di ultra-low temperatures case
PengawetandanPenyimpanan
Continuous culture
Pada media padat atau cair
Refrigeration
Di bawah lapisan minyak mineral
Di dalamair
Pengeringan
Freeze drying
Cryopreservation
PengawetandanPenyimpanan
Bagi biakan awal dan simpan 1 biakan
sebagai seed stock
Simpan satu biakan sebagai cadangan
Setelah pengawetan, viability, purity, dan
identitas harus di cek ulang dan dibandingkan
dengan data aslinya atau referensi
Morfologi, patogenitas, sifat-sifat fisik dan
biokimia harus diuji
Semua pengamatan harus dicatat dan
disimpan untuk referensi di masa yad.
MetodePengawetanmikroorganisme
Penumbuhan pada agar miring
Metode yang paling mudah dan murah
Disimpan di dalam lemari pendingin
dapat membantu mengurangi frekuensi
sub-kultur
Metodepengawetanmikroorganisme
Kerugian metode sub-kultur pd agar
Kemungkinan terjadi variasi genetik
akibat pemindahan berulang, hilangnya
sifat patogenitas atau karakteristik
fisiologi dan morfologi lainnya
Kemungkinan kontaminasi besar
Memerlukan pengawasan yang ketat
supaya biakan tidak tertukar atau
terkontaminasi
PengawetandanPenyimpanan
Keuntungan metode sub-kultur pada agar :
Koleksi biakan dapat disimpan dalam waktu
cukup lama dibawah pengawasan ahlinya.
Metodenya cukup murah dan tidak
memerlukan teknisi khusus. Untuk jumlah
koleksi yang sedikit, metode ini cukup
menguntungkan
Penumbuhan mudah karena tidak perlu
waktu adaptasi yang lama.
Periode pemindahan : 2 4 minggu atau
2 4 bulan
Dibawahminyakmineral
Biakan di atas agar miring di dalam 30 ml universal bottles lalu
dituangkan minyak mineral di atasnya. Hal ini dapat mencegah
dehidrasi dan memperlambat aktivitas metabolisme dan
pertumbuhan karena kurangnya tekanan oksigen
Pengawetandengan
Minyakmineral
Metode ini pertama kali digunakan oleh Buell &
Weston (1947)
Biakan sehat yang cukup usianya ditutup dengan 10
mmminyak mineral steril (liquid paraffin or medicinal
paraffin dengan specific gravity 0.830-0.890).
Minyak disterilkan dengan autoklaf dua kali pada
121C selama 15 menit
Penumbuhan kembali dari minyak dilakukan dengan
cara mengambil sejumlah koloni dengan jarum
biakan dan minyak dibuang sebanyak mungkin.
Cara menginokulasi agar di posisi tengah-tengah
kadangkala memberikan hasil yang lebih baik
sehingga minyak dapat dikeluarkan dengan mudah
melalui slope
Pengawetandalam
Minyakmineral
Kerugian penyimpanan dalam minyak mineral :
Kontaminasi oleh spora mikroba dari udara
Hambatan pertumbuhan pada saat retrieval
Pertumbuhan terus terjadi di bawah kondisi
yang tidak nyaman dapat mengarah pada
mutasi
Pengawetandalam
Minyakmineral
Keuntungan :
Peralatan murah dan pengerjaan mudah
Beberapa mikroorganisme hanya dapat
disimpan di dalamminyak mineral
Namun penyimpanan di bawah minyak mineral
disarankan untuk laboratorium yang memiliki
keterbatasan sumbar daya dan fasilitas
Penyimpanandalamair
Potongan agar atau suspensi spora dapat disimpan dalam air
Penyimpanandalamair
Cara :
1. Potongan agar ukuran 6 mm diambil dari
ujung pertumbuhan koloni jamur
2. Potongan tsb ditempatkan di dalam air steril
di dalam botol McCartney dan tutup erat , lalu
disimpan pada suhu 20-25C.
3. Peremajaan dilakukan dengan mengambil
potongan agar tsb, tempatkan terbalik pada
medium pertumbuhan yang sesuai
Penyimpanandalamair
J angka waktu penyimpanan dapat
mencapai 2-3 tahun , misalnya untuk
spesies of Phytophthora dan Pythium
tanpa adanya perubahan fisik
(Onions & Smith, 1984).
Penyimpanandalamair
Pertama kali dilakukan oleh Castellani (1939,
1967) yang menyimpan fungi yang patogen
thp manusia
Figueiredo (1967) menyimpan 22 patogen
tanaman tanpa kehilangan patogenitasnya.
Figueiredo & Pimentel (1975) melaporkan
penyimpanan dalam air bisa mencapai 10
years
Boeswinkel (1976) menyimpan 650 patogen
a.l. Oomycota, Ascomycota, Basidiomycota
dan mitotic fungi selama 7 tahun.
Ellis (1979) menyimpan Entomophthorales,
Pyrenomycetes, Hymenomycetes,
Gasteromycetes dan Hyphomycetes
Teknikpengeringanandfreezedrying
Penghilangan air akan mengurangi laju
metabolisme sel
Dapat dilakukan dengan pengeringan udara
Dapat pula dengan penambahan absorbant spt
tanah, silica gel, atau desiccant lain.
Cara Freeze-dry dengan vacuum dari keadaan
beku dengan cara sublimasi es
Responseofcellstofreezing.Slowcool:cellscanmaintaingosmostic
equilibriumbywaterefflux;thuscellsshrinkandonlyextracellularice
forms.Rapidcool:cellscannotlosewaterrapidlyenoughtomaintain
osmoticequilibrium;thuscellsshrinkslightlyandcontainafewlarge
icecrystals.Veryrapidcool:cellscontainalargenumberofsmallice
crystals.
SLOW
COOL
RAPID
COOL
VERY
RAPID
COOL
-2
O
C
-5
O
C
< -
10
O
C
What happens to a cell
when it freezes?
PenyimpanandalamSilicaGel
Sporulating fungi dpt disimpan selama 7-18 tahun
C.F. Roberts, University of Leicester menyimpan fungi
lebih dari 25 years menggunakan metode dari Perkins
(1962), semua galur terbukti stabil.
PenyimpanandalamSilicaGel
Cara :
1. Sepertiga penuh botol universal 30 ml isi dengan silica gel dan
sterilkan dengan dry heat (180C selama 3 jam).
2. Tempatkan botol di dalamrak dengan air dan bekukan (nominal
- 20C).
3. Siapkan suspensi spora di dalam 5%(w/v) skimmed milk yang
telah didinginkan.
4. Tambahkan kira-kira 1 ml biakan tersebut ke dalam silica gel
dan goyangkan agar tercampur homogen.
5. Simpan botol dengan tutup longgar selama 10-14 hari pada
25C sampai silica gel crystals mengering dan siap untuk
dipisahkan.
6. Kencangkan tutupnya dan simpan botol pada 4C dalamwadah
kedap udara dengan indicator silica gel untuk mengabsorbsi
lembab.
PenyimpanandalamSilicagel
Banyak fungi yang tahan lama dengan
metode ini (Perkins, 1962; Ogata, 1962;
Onions, 1977; Smith &Onions, 1983).
Spora yang berdinding tipis cenderung tidak
dapat bertahan.
Keberhasilannya tergantung biakan yang
sehat, dan hal ini dapat ditunjukkan dari
perbedaan biakan dari setiap isolat.
Metode ini dpt digunakan bila fasilitas freeze-
drying tidak tersedia, walaupun ada bbrp
fungi yang tidak dapat bertahan lama dgn
cara ini.
PenyimpanandalamSilicaGel
Penumbuhan kembali dgn cara menyebarkan beberapa
kristal ke dalam medium pertumbuhan yang sesuai
PenyimpanandalamSilicaGel
Kekurangan cara silica gel :
Hanya terbatas pada sporulating fungi, dan tidak
sesuai untuk Pythium, Phytophthora dan
beberapa Oomycota, juga beberapa fungi
bermiselium yang memiliki spora yang
kompleks.
Kemungkinan terjadinya kontaminasi cukup
besar setelah beberapa kali peremajaan.
PenyimpanandalamSilicaGel
Keuntungan cara silica gel :
Murah dan sederhana
Menghasilkan biakan yang stabil untuk
banyak sporulating fungi termasuk
Basidiomycota.
Kontaminasi dari bakteri dapat dihindari
karena kondisi yang kering
Peremajaan inokulum dapat dilakukan
dengan mengmbil beberapa butir dari satu
botol, walaupun disarankan tetap
memisahkan biakan stock dari biakan kerja.
Penyimpanandalamtanah
Tanah harus diautoklaf dua kali (121 C for 15 min)
sebelum diinokulasi dengan 1 ml suspensi spora
dalam air steril
Inkubasi pada 20-25 C selama 5-10 days tergantung
pada laju pertumbuhan fungi
Penyimpanandalamtanah
Fusarium (Gordon, 1952; Booth, 1971)
Atkinson (1953) menyimpan Rhizopus, Alternaria,
Aspergillus, Circinella dan Penicillium.
Patogenitas Septoria dari sereal setelah 20 bulan
tetap tinggi (Shearer et al., 1974) dan juga
Pseudocercosporella selama 1 tahun (Reinecke &
Fokkema, 1979).
Gordon's collection menunjukkan bahwa 76% isolat
Fusarium equiseti, 75% F. semitectum dan 50% F.
acuminatum tumbuh tidak terkendali (Booth, 1971).
Penyimpanan dalam tanah sebaiknya digunakan
untuk Fusarium dibandingkan di dalam minyak
karena adanya perubahan (variasi) terjadi dalam
minyak.
Penyimpanandalamtanah
Keuntungan :
Biakan dapat bertahan sampai 10
tahun.
Peremajaan berulang dapat dilakukan
dari sampel yang sama, walaupun
sebaiknya stok harus ditempatkan
terpisah.
Biaya murah dan alat sederhana
Penyimpanandalamtanah
Kerugian :
Kemungkinan terjadi variasi genetik
Beberapa fungi tidak dapat tahan di
desikasi
Kemungkinan kontaminasi lebih besar
Oomycota
Paling baik disimpan di bawah nitrogen cair
dengan kecepatan pendinginan 10C min-1,
walaupun beberapa galur tidak dapat disimpan
dengan cara ini.
Di bawah minyak mineral dapat disimpan
sampai 6 bulan
Tiga galur Phytophthora dapat tahan sampai 40
tahun (laporan dari CABI-UK)
Kultur dapat disimpan dalamair namun perlu di
transfer setiap 2 tahun
Zygomycota
Nitrogen cair sangat disarankan untuk
penyimpanan Mucor, Rhizopus dan genus
lainnya
Dapat pula dengan cara freeze-dried
Tidak semua genus tahan proses dehidrasi,
terutama dengan silica gel, misalnya
Coemansia, Martensiomyces, Condiobolus,
Entomophthora, Piptocephalis and Syzygites.
Dari genus2 ini, hanya Piptocephalis dan
Coemansia yang dapat di freeze dried.
Basidiomycota
Umumnya tumbuh dalam bentuk miselium Fungi
demikian hanya dapat disimpan dengan cara
transfer regular pada agar dengan atau tanpa
minyak, atau disimpan di nitrogen cair.
Fungi tersebut menghasilkan dinding hifa yang
tebal jadi mudah di freeze-dried tetapi sukar
ditumbuhkan kembali
Basidiospores yang diperoleh dari fungi yang
tumbuh di alam, dapat di freeze-dried
FungiDeuteromycota
Fungi yang ber konidia reltif mudah di
simpan
Freeze-drying adalah teknik yang paling
tepat.
Aspergillus, Penicillium and Paecilomyces
dapat disimpan mulai dari 6 bulan sampai
2 tahun pada agar miring pada -18C.
Ragi
Ragi (single celled vegetative yeasts)
dapat disimpan dengan cara freeze-
drying.
Kebanyakan spesies dapat tahan
disimpan dalamsilica gel namun sukar
ditumbuhkan kembali
Liquid nitrogen adalah cara yang paling
baik.
Rangkuman
Method Cost Stability Longevity
Cryopreservation
below 130
o
C
High Excellent >10 000
years
Freeze-drying High Little change
reported
4-40 years
Silica gel Low Little change
reported
5-20 years
Water Low Variation linked
to storage time
2-7 years
Soil Low Variation
common
5-20 years
Oil Low Change
expected with
time
1-50 years
Growth 18-22
o
C Low-Medium Change
expected with
time
2 weeks to
6 months
Growth 4-7
o
C Medium Change
expected with
time
6-12
months