ENZIM (SIFAT SIFAT UMUM)

Kontribusi : Wheny

BAB I

PENDA U!UAN
"#" !$t$r Be%$&$n' Enzim merupakan polimer biologik yang mengatalisis lebih dari satu proses dinamik yang memungkinkan kehidupan seperti yang kita kenal sekarang. Sebagai determinan yang menentukan kecepatan berlangsungnya berbagai peristiwa fisiologik, enzim memainkan peranan sentral dalam masalah kesehatan dan penyakit. Pemecahan makanan untuk memasok energi serta unsur-unsur kimia pembangunan tubuh (building blocks) perakitan building blocks tersebut men!adi protein, membran sel, serta "#$ yang mengkodekan informasi genetik dan akhirnya penggunaan energi untuk menghasilkan gerakan sel, semua ini dimungkinkan dengan adanya ker!a enzim-enzim yang terkoordinasi secara cermat. Sementara dalam keadaan sehat semua proses fisiologis akan berlangsung dalam cara yang tersusun rapi serta teratur dan homeostatis tetap dipertahankan, homeostatis dapat mengalami gangguan berat pada keadaan patologis. Sebagai contoh, cedera !aringan hebat yang mencirikan penyakit sirosis hepatis dapat menimbulkan gangguan berat pada kemampuan sel membentuk enzim-enzim yang mengatalisis berbagai proses metabolisme penting seperti sintesis ureum. %etidakmampuan mengubah ammonia yang toksik men!adi ureum yang nontoksik sebagai akibat dari penyakit tersebut akan diikuti dengan intoksikasi ammonia, dan akhirnya koma hepatikum. Suatu spektrum penyakit genetik langka tetapi yang sering sangat menurunkan keadaan umum penderitanya dan kerap fatal, memberi contoh-contoh tambahan dramatis tentang konsekuensi fisiologis drastis yang dapat menyertai gangguan terhadap akti&itas bahkan hanya satu enzim. 'enyusul suatu cedera !aringan berat (misal, infark !antung atau paru, cedera remuk pada anggota gerak) atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali (misal, karsinoma prostat), enzim yang mungkin khas bagi !aringan tertentu akan dilepas ke dalam darah. "engan demikian, pengukuran terhadap enzim intrasel ini didalam

serum dapat memberikan informasi diagnostik dan prognostic yang tidak ternilai bagi dokter.

"#( )u*us$n M$s$%$h )erdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan beberapa permasalahan sebagai berikut* () +) ,) -) %lasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi. Enzim memerlukan koenzim. Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur, fungsi, mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim. Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik

"#+ Tu,u$n )erdasarkan rumusam masalah maka makala ini bertu!uan sebagai berikut* () +) ,) -) 'engetahui %lasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi. 'engetahui bahwa Enzim memerlukan koenzim. 'engetahui Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur, fungsi, mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim. 'engetahui Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik

BAB II PEMBA ASAN (#" ENZIM DIK!ASIFIKASIKAN BE)DASA)KAN TIPE DAN

MEKANISME )EAKSI Satu abad lalu, baru ada beberapa enzim yang dikenal dan kebanyakan di antaranya mengatalisis reaksi hidrolisis ikatan ko&alen. Semua enzim ini diidentifikasi dengan penambahan akhiran .ase pada nama substansi atau substrat yang dihidrolisisnya. /adi, %i-$se menghidrolisis lemak (0unani lipos), $*i%$se menghidrolisis pati (0unani amylon), dan -rote$se menghidrolisis protein. 'eskipun banyak sisa peristilahan ini masih tetap bertahan sampai sekarang, pemakaiannya sudah terbukti tidak memadai ketika ditemukan berbagai enzim yang mengatalisis reaksi yang berbeda terhadap substrat yang sama, misal, oksidasi atau reduksi terhadap fungsi alcohol suatu gula. Sementara akhiran -ase tetap digunakan, nama enzim yang ada sekarang ini lebih menekankan pada tipe reaksi yang dikatalisisnya. Sebagai contoh, enzim dehidrogenase mengatalisis pengeluaran hidrogen, sementara enzim transferase mengatalisis reaksi pemindahan gugus. "engan semakin banyaknya enzim yang ditemukan, ketidak!elasan !uga semakin tak terelakkan, dan kerap kali tidak !elas enzim mana yang tengah dibicarakan oleh seorang penyelidik. 1ntuk mngatasi permasalahan ini, International Union of Biochemistry (21)) telah mengadopsi sebuah sistem yang kompleks tetapi tidak meragukan bagi peristilahan enzim yang didasarkan pada mekanisme reaksi. 'eskipun ke!elasan dan pengurangan keraguan tersebut membuat sistem nomenklatur 21) dipakai untuk u!ian riset, nama yang lebih pendek tetapi kurang begitu !elas tetap digunakan dalam buku a!ar dan laboratorium klinik. %arena alasan tersebut, sistem 21) hanya disampaikan secara sepintas. () 3eksi dan enzim yang mengatalisis reaksi tersebut membentuk enem kelas, masing-masing mempunyai --(, subkelas. +) #ama enzim terdiri atas + bagian. #ama pertama menun!ukkan substrat. #ama kedua, yang berakhir dengan akhiran . ase, menyatakan tipe reaksi yang dikatalisis. ,) 2nformasi tambahan, bila diperlukan untuk men!elaskan reaksi, dapat dituliskan dalam tanda kurung pada bagian akhir misal, enzim yang mengatalisis ,

reaksi 4-malat 5 #$"5 piru&at 5 67+ 5 #$"8 5 8 malat* #$"5 oksidoreduktase (dekarboksilasi).

diberi nama (.(.(.,9 4-

-) Setiap enzim mempunyai nomor kode (E6) yang mencirikan tipe reaksi ke dalam kelas (digit pertama), subkelas (digit kedua), dan subsubkelas (digit ketiga). "igit keempat adalah untuk enzim spesifik. /adi, E6 +.9.(.( menyatakan kelas + (transferase), subkelas 9 (transfer fosfat), subsubkelas ( (alcohol merupakan aseptor fosfat). "igit terakhir menyatakan heksokinase atau $:P* "-heksosa ;fosfotrasferase, sebuah enzim yang mengatalisis pemindahan fosfat dari $:P ke gugus hidroksil pada atom karbon keenam molekul glukosa. (#( ENZIM MEME)!UKAN K.ENZIM )anyak enzim yang megatalisis proses pemindahan gugus dan reaksi lain memerlukan, di samping substratnya, sebuah molekul organik sekunder yang dikenal sebagai koenzim karena tanpa koenzim, enzim tersebut tidak aktif. %oenzim akan memperbesar kemampuan katalitik sebuah enzim sehingga men!adi !auh melebihi kemampuan yang ditawarkan hanya oleh gugus fungsional asam aminonya, yang menyusun massa enzim tersebut. %oenzim yang berikatan secara erat dengan enzim lewat ikatan ko&alen atau gaya nonko&alen kerap kali disebut sebagai 'u'us -rosteti&.. %oenzim yang mampu berdifusi secara bebas umumnya berfungsi sebagai unsur pembawa (yang didaur ulang secara kontinu) hydrogen (<$"8), hidrida (#$"8 dan #$"P8), atau unit-unit kimia seperti gugus asil (koenzim $) atau gugus metil (folat), membawanya bolak-balik antara tempat pembentukannya dan pemakaiannya. 7leh karena itu, koenzim yang disebut belakangan ini dapat dianggap sebagai substrat sekunder. /enis-!enis enzim yang membutuhkan koenzim adalah enzim yang mengatalisis reaksi oksidoreduksi, pemindahan gugus serta isomerisasi, dan reaksi yang membentuk ikatan ko&alen (kelas 21) (,+,=, dan ;). 3eaksi lisis, termasuk reaksi hidrolisis yang dikatalisis oleh enzim-enzim pencernaan, tidak memerlukan koenzim. (#(#" Koen/i* D$-$t 0i$n''$- Seb$'$i Subtr$t Se&un0er 1ntuk dua laasan penting, akan sering kali membantu untuk menganggap koenzim sebagai substrat sekunder. $lasan pertama, perubahan kimia di dalam koenzim ter!adi tepat mengimbangi perubahan kimia yang berlangsung di dalam

substrat. Sebagai contoh, dalam reaksi oksideruduksi, !ika satu molekul substrat dioksidasi, satu molekul koenzim akan direduksi. $alsan kedua untuk memberi koenzim penghargaan yang sama adalah bahwa aspek reaksi ini mungkin mempunyai makna fisiologik mendasar yang lebih besar. Sebagai contoh, peran penting kmampuan otot yang beker!a secara anaerob untuk mengubah piru&at men!adi laktat tidak terletak pada piru&at ataupun laktat. 3eaksi tersebut semata-mata bertu!uan mengoksidasi koenzin #$"8 yang tereduksi men!adi #$"5. :anpa #$"5 glikolisis tidak dapat berlan!ut dan sintesis $:P $naerob (dan dengan demikian, akti&itas ker!annya) akan terhenti. "i bawah keadaan anaerob, reduksi piru&at men!adi laktat menghasilkan oksidasi ulang #$"8 dan memunkinkan sintesis $:P. 3eaksi lain dapat melakukan funsi ini sama baiknya. Sebagai contoh pada bakteri atau ragi yang tumbuh secara anaerob, metabolit yang berasal dari piru&at bertindak secara oksidan bagi #$"8 dan mereka sendiri berada dalam keadaan tereduksi. 78 68 7 7 6 7

8,6

6
2-4aktat

8,6

6
Piru&at

#$"5

#$"8 5 85

1$*b$r : NAD2 be&er,$ seb$'$i &osubstr$t 0$%$* re$&si %$&t$t hi0ro'en$se#

:abel . 'ekanisme bagi regenerasi $naerob #$"5 7ksidan Piru&at $setaldehid "ihidroksiasoton fosfat <ruktosa Produk :ereduksi 4aktat Etanol ->liserofosfat 'atinol )entuk %ehidupan 7tot, bakteri laktat, ragi (yeast) Eschrichia coli bakteri heterolaktat

(#(#( Fun'si Koen/i* seb$'$i )e$'ensi$ Pe*in0$h 1u'us :ipe reaksi biokimia pemindahan gugus ".>5$ $.>5"

0ang memindahkan gugus molekul fungsional (>) dari molekul donor ("->) kepada sebuah molekul aseptor akhir (misal, reaksi dahidrogenasi) atau sebagai pembawa gugus intermediet (misal, reksi transaminasi). "iagram berikut melukiskan konsep yang disebut terakhir ini. ". 8 %oE $.8

"

%oE - 8

'eskipun diagram ini mengesankan pembentukan hanya satu kompleks %oE-> tunggal saat berlangsungnya seluruh reaksi, sebenarnya ada berbagai kompleks intermediet %oE-> yang dapat terlibat dalam suatu reaksi tertentu (misal, transaminasi). /ika gugus yang dipindahkan merupakan hydrogen, adalah biasa untuk menggambarkan hanya ?separuh reaksi@ di sebelah kiri* ". 8 %oE

"

%oE - 8

)ahwa hal ini sebenarnya merepresentasikan hanya suatu kasus khusus dari pemindahan gugus yang biasa dapat paling mudah dipahami dalam pengertian reksi yang berlangsung di dalam sel utuh. (#(#+ Koen/i* D$-$t Di&%$si3i&$si&$n Menurut 1u'us y$n' Pe*in0$h$nny$ Di-er*u0$h o%eh Koen/i* tersebut )erdasarkan konsep di atas, kita dapat mengklasifikasikan koenzim sebagai berikut* 1ntuk pemindahan gugus bukan hydrogen* >ula fosfat %o$-S8 :iamin pirofosfat Piridoksal fosfat %oenzim folat )iotin %oenzim kobamida ()(+) $sam lipoat 1ntuk pemindahan hidrogen* #$"5, #$"P5 <'#, <$" $sam lipoat %oenzim A (#(#4 B$ny$& Koen/i* Meru-$&$n Deri5$t 6it$*in B 0$n Deri5$t A0enosin Mono3os3$t Bitamin ) membentuk bagian dalam struktur banyak koenzim. Bitamin ) ni&otin$*i0$7 ti$*in7 ribo3%$3in dan $s$* -$ntoten$t merupakan unsur esensial yang membentuk koenzim bagi oksidasi serta reduksi biologik, dan koenzim &ob$*i0$ serta $s$* 3o%$t berfungsi dalam metabolisme satu karbon. )anyak koenzim mengandung adenin, ribose, serta fosfat, dan merupakan dari&at adenosin monofosfat ($'P). 6ontoh-contohnya mencakup #$"5 dan #$"P5.

(#+

ENZIM MEN1ATA!ISIS )EAKSI SPESIFIK ATAU )EAKSI TIPE %esanggupan enzim mengatalisis satu reaksi spesifik dan pada hakikatnya tidak

mengatalisis reaksi yang lain mungkin merupakan sifat enzim yang paling signifikan. 4a!u proses metabolisme karenanya dapat diatur oleh perubahan dalam efisiensi katalitik enzim spesifik. )anyak enzim mengatalisis !enis reaksi yang sama (pemindahan fosfat, reduksi-oksidasi, dl) dengan hanya se!umlah kecil substrat yang secara structural berhubungan, kendati sering pada kecepatan reaksi yang secara bermakna lebih rendah. )erbagai reaksi dengan substrat alternatif ini cenderung ter!adi kalau substrat terdapat dalam konsentrasi yang tinggi. 'eskipun kadar sedemikian !arang ditemukan di dalam sel hidup, kadar ini dapat diciptakan di laboratorium. "isini, substrat alami dan sintetik alternatif digunakan untuk memfasilitasi pendeteksian enzim dan penelitian mengenai mekanisme katalitiknya.

1$*b$r : Pelekatan tiga titik sebuah substrat ke tapak . aktif enzim yang berbentuk planar (#+#" En/i* Me*-er%ih$t&$n S-esi3isit$s .-tis %ecuali enzim epimerase (rasemase) yang mengatalisis interkon&ersi isomer optis, umumnya semua enzim akan memperlihatkan spesifisitas optis absolut untuk paling tidak suatu porsi molekul substrat. "engan demikian, enzim dari lintasan glikolisis dan oksidasi langsung akan mengatalisis interkon&ersi gulafosfat-" tetapi tidak gulafosfat-4. "engan beberapa pengecualian (misal, enzim "-asam amino oksidase pada gin!al), kebanyakan enzim mamalia beker!a pada isomer-4 asam amino. Spesifisitas optis dapat meluas hingga satu porsi tertentu atau hingga keseluruhan melekul substrat tersebut. Enzim glikosidase menggambarkan kedua u!ung ekstrem. Enzim ini mengatalisis hidrilisis ikatan glikosida antara gula dan

alcohol, bersifat sangat spesifik untuk bagian gula serta untuk ikatan ( atau ), tetapi relatif nonspesifik untuk aglikon (porsi alcohol). (#+#( En/i* Bersi3$t S-esi3i& b$'i Ti-e )e$&si y$n' Di&$t$%isisny$ Enzim untuk proses lisis (enzim lisis) beker!a pada kelompok kimia khusus, misal, enzim glikosidase pada glikosida, pepsin serta tripsin pada ikatan peptida, dan esterase pada senyawa-senyawa ester. )erbagai substrat peptida yang berbeda dapat diserang oleh hanya satu enzim sehingga mengurangi !umlah enzim pencernaan yang seharusnya diperlukan. Enzim protease dapat pula mengatalisis proses hidrolisis senyawa ester. Penggunaan ester sebagai substrat untuk sintesis telah mempermudah penelitian terhadap mekanisme ker!a enzim protease. Enzim-enzim lisis tertentu memperlihatkan spesifisitas yang lebih tinggi. Enzim kimotripsin menghidrolisis ikatan peptida pada reaksi ini, gugus karboksil berasal dari asam amino aromatik fenilalanin, tirosin, atau triptofan. Enzim karboksipeptidase dan aminopeptidase melepas asam-asam amino satu persatu, masing-masing secara berturutan, dari u!ung terminal karboksil atau terminal amino rantai polipeptida. 'eskipun beberapa enzim oksidoreduktase memanfaatkan #$" 5 dan #$"P5 sebagai akseptor elektronnya, kebanyakan hanya menggunakan salah satu di antaranya. Secara umum, enzim oksidoreduktase yang berfungsi dalam proses biosintesis sistem-sistem mamalia (misal, sintesis asam lemak atau sterol) menggunakan #$"P8 sebagai reduktan sementara enzim yang berfungsi dalam proses penguraian (misal, glikolisis, oksidasi asam lemak) menggunakan #$"5 sebagai oksidan. (#4 AKTI6ITAS KATA!ITIS 8AN1 DIMI!IKI ENZIM MEMFASI!ITASI PENDETEKSIAN ENZIM TE)SEBUT /umlah enzim yang kecil di dalam sel mempersulit pengukuran kadarnya di dalam ekstrak !aringan atau cairan. 1ntungnya, akti&itas katalitis yang dimiliki enzim dapat men!adi sarana pemeriksaan yang sensiti&e dan spesifik bagi pengukuran kadar enzim itu sendiri. %emampuan mengatalitis transformasi ribuan, puluhan ribu, atau bahkan lebih molekul substat men!adi produk dalam periode waktu yang singkat memberikan kepada setiap molekul enzim kemampuan untuk secara kimiawi menguatkan keberadaannya.

1ntuk mengukur kadar enzim di dalam sebuah sampel ekstrak !aringan atau cairan biologik lain, kecepatan reaksi yang dikatalitis oleh enzim dalam sampel tersebut harus ditentukan. "alam kondisi yang tepat, hasil pengukuran kecepatan reaksi harus sebanding dengan !umlah enzim yang ada. %arena !umlah molekul atau massa enzim yang ada sukar ditentukan, hasil pengukuran tersebut dinyatakan dalam unit en/i*.. /umlah relatif enzim dalam berbagai ekstrak kemudian dapat dibandingkan. International Union of Biocemistry mengartikan satu unit akti&itas enzim sebagai ( mikromol (( mol (E-;) substrat yang bereaksi atau produk yang ditransformasikan per menit. (#4#" K$0$r Dehi0ro'en$se Ter'$ntun'9NAD2 Diu&ur -$0$ +4: n* "alam reaksi yang melibatkan #$" 5 atau #$"P5 (enzim-enzim dehidrogenase), sifat #$"8 atau #$"P8 (tetapi bukan #$" 5 atau #$"P5 ) yang menyerap cahaya dengan pan!ang gelombang ,-E nm (>ambar C--) membawa manfaat. 7ksidasi #$"8 men!adi #$"5 ter!adi disertai dengan penurunan densitas optik (7", optical density) pada ,-E nm, yang proporsional dengan !umlah #$"8 yang dioksidasi. "emikian pula, kalau #$"5 direduksi, 7" pada ,-E nm akan meningkat sebanding dengan !umlah #$"8 yang terbentuk. Perubaahan 7" pada ,-E nm ini dapat dimanfaatkan bagi pemeriksaan analisis kuantitatif setiap enzim dehidrogenase yang bergantung #$"5 atau #$"P5 sebagai berikut. )agi enzim dehidrogenase yang mengatalitis oksidasi #$"8 oleh substratnya yang teroksidasi, kecepatan penurunan 7" pada ,-E nm akan berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. 7leh karena itu, hasil pengukuran kecepatan oenurunan 7" pada ,-E nm memungkinkan kita menyimpulkan kuantitas enzim, yang dinyatakan dengan unit akti&&itas, yang terdapat di dalam sampel biologik tertentu seperti serum atau ekstrak !aringan

(E

0,8 Densitas Optik

0,6 #$"8 0,4

0,2 #$"5 0 200 250 300 350 400 Panjang gelombang (nm) 1$*b$r : Spektrum $bsopsi #$"5 dan #$"8. "ensitas yang tampak di sini adalah untuk -- 'gF4, larutan di dalam sebuah sel dengan lintasan cahaya ( cm #$"P5 mempunyai spectrum yangmasing-masing analog dengan spectrum #$"5 dan #$"8. (#4#( K$0$r B$ny$& En/i* D$-$t Diu&ur 0en'$n Mer$n'&$i&$nny$ -$0$ En/i* Dehi0ro'en$se Pada contoh diatas, la!u pembentukan produk (#$"8) diukur untuk menentukan akti&itas enzim. Enzim selain dehidrogenase diukur kadarnya lewat pengukuran kecepatan kemunculan produk (atau, yang lebih !arang dilakukan, lewat pengukuran kecepatan hilangnya substrat). Sifat-sifat fisiokimiawi produk atau substrat akan menentukan metode spesifik yang dipilih untuk mengukur kadar enzim. 6ara yang sering dan mudah dilakukan adalah ?merangkaikan@ (coupling) produk reaksi dengan sebuah enzim dehidrogenase, dengan produk srbagai substrat.

((

(#;

ENZIM MU)NI BE)FUN1SI SAN1AT PENTIN1 BA1I PEMA AMAN ST)UKTU)7 FUN1SI7 MEKANISME )EAKSI7 DAN PEN1ATU)AN ENZIM# :u!uan yang ingin dicapai dalam pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim

spesifikasi dan ekstra sel ?'entah@ (crude) yang mengandung banyak komponen lain. 'olekul-molekul kecil dapat disingkirkan lewat dialysis atau filtrasi gel, asam nukleat melalui pngendapan dengan antibiotik streptomisin, dan seterusnya. Permaslahannya adalah memisahkan enzim yang kita kehendaki dari ratusan protein yang mempunyai stuktur kimia dan fisika yang seupa. Per!alanan suatu pemurnian tipikal dan enzim hati dengan pemulihan yang baik serta pemurnian keseluruhan yang besarnya mencapai -DE kali lipat. >lukosa
8E%S7%2#$SE

$:P, 'g +5 $"P, 'g+5 >lukosa-;-<osfat #$"P5

>41%7S$-;-<7S<$: "E82"37>E#$E

#$"P ;-<osfoglukonolakton

5 85

En/i* Di-ero%eh 0$ri Su*ber9Su*ber A%$*i $t$u 0$ri Se% Te*-$t En/i* Tersebut Sie&s-resi&$n o%eh 1en y$n' 0iK%on# "ulu, riset awal terhadap enzim terbatas pada protein yang dapat dimurnikan dari sel-sel binatang, tanaman, atau bakteri tempat enzim tersebut terdapat secara alami. Sekarang, teknologi DNA re&o*bin$n telah memungkinkan ilmuwan memprouksi protein di dalam sel tempat protein tersebut normalnya tidak ditemukan. Sel-sel hospes tipikal adalah bakteri dan ragi yang secara kuantitas mudah tumbuh. %emmapuan mengekspresikan protein rekombinan pada tingkat yang relatif tinggi men!adikan para ilmuwan mempu mengisolasi enzim yang sulit dimurnikan karena konsentrasi rendahnya di dalam sel tempat mereka ditemukan secara alami. 4ebih lan!ut, melalui perubahan "#$ yang mengkodekan protein melalui mutagenesis (+

berorientasi .tapak (site-directed mutagenesis), para 2lmuwan dapat menambah, menghilangkan, atau mengubah asam-asam amino spesifik dalam enzim rekombinan untuk untuk memfasilitasi penentuan peran fungsional dan strukturalnya. Perubahan dapat pula dilakukan untuk membuat protein lebih mudah dimurnikan. )agaimanapun, pmurnian enzim dan sumbernya yang alami tetap merupakan hal yang penting, khususnya guna mengidentifikasi sifat serta peran modifikasi posstranslasi yang yang berfungsi mengatur lokasi enzim serta efisiensi katalik. Pe*urni$n Di%$&u&$n *en''un$&$n Kro*$to'r$3i -$0$ -ertu&$r$n Ion $t$u -$0$ Peny$n''$ Penyisih U&ur$n# Porosdur pemurnian klasik yang bermanfaat adalah pengendapan dengan berbagai konsentrasi garam (umumnya garam ammonium atau natrium sulfat) atau pelarut (aseton atau etanol), pemanasan diferensial atau denaturasi P8 "iferensil, sentifugasi diferensial, filtrasi gel, dan elektroferosis. $dsopsi selektif dan elusi protein dari zat penukar anio selulosa, yaitu deitilaminoetil ("E$E) selulosa dan zat penukar anion selulosa, yaitu karboksimetil selulosa (6'6, carbokxymethylcellulose) !uga telah memberikan hasil yang sangat baik bagi pemurnian protein secara cepat dalam !umlah besar. Sebagi contoh,P8 ekstrak ekuesosa !aringan hati diatur hingga 9, = yang pada P8 ini, sebagian besar protein akan memiliki muatan netto negatif. 6ampuran protein dapat larut ini kemudian dialirkn lewat kolom selulosa "E$E pada P8 9.= bemuatan negatif akan terikat ke "E$E lewat interkasi muatan yang berlawanan, sementara protein yang tidak bermuatan atau yang mempunyai muatan positif mengalir langsung lewat kolom tersebut. %emudian, kolom selulosa "E$E ini dielusikan menggunakan gradien #a6l, yang memiliki kisaran dari konsntrasi rendah hingga tinggi, dan dilarutkan dalam pendapan denganP8 9,=. karena 6l - bersaing dengan protein untuk berikatan ke penyangga yang bermuatan positif, protein untuk elusikan secara selektif protein yang memiliki ikatan paling lemah diikat paling awal, dan protein yang memiliki ikatan paling kuat diikat palinh akhir. Pemisahan protein analog dolakukan mengyunakn penyangga bermuatan negatif seperti karboksimetilselulosa atau fosfoselulosa pada P8 yang sedikit lebih rendah untuk memastikan bahwa protein bermuatan lebih positif. Pemisahan protein dapat pula dilakukan pada baha berpori yang dikenal sebagai ?ayakan molecular@.. %alau campuran protein dialirkan lewat kolom yang (,

mengandung ayakan molecular, protein yang berukuran kecil akan tersebar baik di dalam ruang antar partikel maupun di dalam ruang internal atau pori-pori penyangga. %etika campuran protein dengan ukuran yang berbeda-beda mengalir lewat kolom, mobilitas protein yang berukuran kecil akan terhambat, relatif terhadap protein yang ukurannya terlalu besar untuk masuk ke dalam pori- poi ini. "engan demikian,protein berukuran besar akan muncul dari dalam kolom sebelum protein yang berukuran kecil. :abel * 3angkuman skema pemurnian enzim tipikal
<raksi Enzim $kti&itas :otal (m1)( 8omogenat hati mentah 6airan supernatan, pemusingan (EE.EEE G g Endapan H#8-I+S7- -E . =E J Endapan aseton +E . ,= J <raksi kolom "E$E CE . ((E Endapan H#8-I+S7- -, . -C J %ristal pertama 3ekritalisasi (EE.EEE DC.EEE DE.EEE ;E.EEE =C.EEE =+.EEE =E.EEE -D.EEE Protein :otal (mg) (E.EEE C.EEE (.=EE +=E +D +E (+ (E $kti&itas Spesifik (m1Fmg) (E (+, + ;E +-E +.EEE +.;EE -.(;E -.DEE Pemulihan %eseluruhan ((EE) DC DE ;E =C =+ =E -D

Peny$n''$ Kro*$to'r$3i A3init$s M$*-u Men'en$%i )e'io En/i* S-esi3i& 6iri yang menon!ol pada kromatografi afinitas adalah kemampuannya untuk secara selektif mengeluarkan satu protein tertentu, atau yang paling sering, se!umlah kecil protein tertentu, dari campuran protein yang kompleks. :eknik ini menggunakan suatu ligand tak bergerak yang mengadakan interaksi spesifik dengan enzim yang ingin dimurnikan. %alau campuran protein tersebut dipan!ankan pada ligand tersebut. Protein yang tidak di kehendaki akan mengalir lewat kolom dan dibuang. Protein yang di kehendaki kemudian akan dielusikan dari ligan yang tak bergerak memakai cairan elusi yang umumnya berupa larutan garam atau ligand berbentuk larut dengan konsentrasi tinggi. Permunian yang dicapai melalui teknik kromatografi afinitas ini sangat mengesankan dan sering melebihi hasil yang mungkin di peroleh dengan pemakaian se!umlah teknik klasik secara berturutan 4igand yang di suka adalah substrat serta deri&at koenzim atau zat perwarna organic yang bertindak sebagai nukleotida atau analog koenzim yang berikatan secara ko&alen dengan sebuah penyangga inert (misal, #$"-SpandeG, )lue Sepharose).

(-

4igand ini secara khas berikatan dengan penyangga lewat molekul penghubung.0ang mempunyai pan!ang tiga hingga delapan atom karbon. Pada kromatografi yang bersifat hidrofobik, hidrokarbon, alkil atau aril akan terikat ke penyangga seperti sephadeG. 3etensi protein pada penyangga ini melibatkan interaksi hidrofobik antara rantai alkil dan regio hidrofobik pada protein tersebut. Protein kemudian di masukan ke dalam larutan yang menggandung garam dengan konsentrasi tinggi (misal, H#8-I+S7-) dan dielusikan dengan garam yang sama yang memiliki gradien menurun. Te&no%o'i DNA )e&o*bin$n D$-$t Men,$0i Su*ber En/i* 8$n' K$y$ )anyak gen yang mengkodekan enzim telah diklon, ditentukan rangkaiannya, dan disisipkan ke dalam &ector yang berasal dari plasmid atau faga tempat gen tersebut dapat di kontrol oleh suatu promoter yang kuat. Promoter tersebut dapat ?mendorong@ produksi enzim rekombinan hingga mencapai taraf yang !auh lebih tinggi dibandingkan dengan yang terdapat pada sumber . sumber alam. "engan menggunakan promoter yang diatur oleh zat penginduksi (inducer) kimia spesifik, ekspresi enzim rekombinan dapat diatur secara cermat. 1mumnya &ector ekspresi semacam ini disisipkan ke dalam mikroorganisme yang mudah tumbuh seperti Escherichia coli atau ragi untuk memproduksi enzim rekombinan. Protein Fusi )e&o*bin$n Di*urni&$n 0en'$n &ro*$to'r$si $3init$s "isamping menghasilkan sumber yang kaya akan enzim, yang sangat memfasilitasi pemurnian, teknologi "#$ rekombinan dapat digunakan untuk menciptakan protein termodifikasi yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas. 6ara yang umum dilakukan adalah dengan mengikatkan kepada gen, se!umlah rangkaian nukleutida yang kKmengkodekan ekstensi protein sehingga terbentuk protein fusi yang merupakan ligand yang baik bagi penyangga afinitas spesifik. Salah satu pendekatan yang popular adalah denngan mengikatkan rantai yang terdiri atas lima atau enam asam amino histidin atau sebagai alternatif lain, domain pengikat substrat untuk enzim glutation S-trasferase kepada gugus terminal amino atau karboksil enzim yang bersangkutan. Protein fusi rekombinan trsebut kemudian dapat dimurnikan pada kolom afinitas yang berisi ion logam bi&alen terikat seperti #i+5 (untuk fusi dengan polihistidin) atau glutation terikat (untuk protein fusi glutation S-trasferase) (>ambar C-;).Protein fusi sering mengandung tapak (site) pembelahan untuk protease yang sangat spesifik seperti trombin, pada regio yang menghubungkan kedua bagian dari

(=

protein fusi tersebut. 8al ini memungkinkan pengeluaran domain fusi tambahan tersebut setelah pemurnian afinitas.
>S:

Enzim "#$ 8asil klon yang mengkodekan enzim 4igasikan men!adi satu

>S: yang mengkodekan plasmid "engan tapak trombin

>S:

Enzim

4akukan tranfeksi sel, tambahkan zat Penginduksi, kemudian lakukan pemecahan zat $lirkan kedalam kolom afinitas glutation (>S8) Enzi m lakukan alusi dengan >S8 proses

>S:

>S:

dengan trombin

>S:

>S:

Enzi m

1$*b$r : Penggunaan protein .fusi glutation S-tranferae (>S:) untuk pemurnian enzim rekombinan

(;

E%e&tro3oresis 1e% Po%i$&ri%$*i0$ D$-$t Men0ete&si Kont$*in$n Penilaian homogeneitas protein paling baik dilakukan dengan elektroforesis gel poliakrilamida (P$>E, polyacrylida gel electrophoresis) di bawah berbagai kondisi. 0ang paling popular di antaranya adalah elektroforesis gel poliakrilamida atau P$>E dengan sodium dodesil sulfat (S"S), suatu detergen ion yang memisahkan protein multimerik men!adi protomer. %arena setiap ikatan peptida mengikat kurang lebih dua buah molekul S"S, polipeptida tersebut memiliki muatan negatif yang kuat. "engan demikian, !arak yang ditempuh setiap polipeptida ketika bermigrasi kearah anoda bergantung pada massa molecular relatifnya ('r). Sebagai alternatif lain, P$>E dapat dilaksanakan dalam kondisi asli yaitu, tanpa adanya S"S atau denaturan lain sehingga struktur kuaterner dan kerap kali pula akti&itas katalitik enzimnya dapat dipertahankan. "alam P$>E dua dimensi (7L<arrell), dimensi pertama memisahkan protein yang terdenaturasi berdasarkan nilai pl-nya dengan melakukan ekuilibrasi protein tersebut di dalam medan listrik yang mengandung urea dan dengan gradien p8 yang dipertahankan oleh amfolit terpolimerisasi. Setelah pemrosesan dengan S"S selesai, dimensi kedua kemudian memisahkan protein berdasarkan ukuran molecular unit protomernya. (#< ENZIM DAPAT DITEMUKAN DI DA!AM .)1ANE! SPESIFIK Susunan spasial dan kompartementalisasi enzim, substrat, serta kofaktor di dalam sel mempunyai makna yang teramat penting. Sebagai contoh, di dalam sel-sel hati, enzim untuk glikolisis terdapat di dalam sitoplasma sedangkan enzim untuk siklus asam sitrat di dalam mitokondria. "istribusi enzim diantara berbagai organel subselular dapat dipela!ari setelah dilakukan fraksionasi homogenat sel melalui sentrifugasi berkecepatan tinggi. %andungan enzim pada setiap fraksi kemudian diperiksa. Penentuan lokasi suatu enzim tertentu didalam sebuah sel atau !aringan pada keadaan yang relatif tetap acapkali dilakukan dengan prosedur histokimiawi (?histoenzimologi@). Sayatan tipis !aringan yang dibekukan (frozen section) dengan ketebalan + hingga (Em diproses dengan substrat untuk suatu suatu enzim tertentu. "i mana terdapat enzim, di situ akan terbentuk produk dari reaksi yang dikatalisis enzim tersebut. /ika terwarna dan tidak larut, produk akan tetap berada di tempat

(9

pembentukannya dan mengungkap lokasi enzim. 8istoenzimologi menghasilkan gambar grafik dan pola yang relatif bersifat fisiologik mengenai distribusi enzim. (#= IS.ZIM ME)UPAKAN BENTUK 8AN1 MEMPUN8AI PE)BEDAAN FISIK TETAPI DEN1AN AKTI6ITAS KATA!ISIS 8AN1 SAMA %alau teknik pemurnian enzim diaplikasikan, sebagai contoh kepada enzim malat dehidrogenase yang berasal dari sumber yang berbeda (misal, hati tikus dan escherichia coli), kita akan melihat dengan !elas bahwa sekalipun enzim malat dehidrogenae yang berasal dari hati tikus maupun E coli akan mengatalisis reaksi yang sama, sifat-sifat fisik dan kimiamereka memperlihatkan banyak perbedaan bemakna. )netuk . bentuk fisik berbeda dari akti&itas yang ama !uga dapat ditemukan dalam berbagai !aringan organisme yang sama, dalam tipe-tipe sel yang berbeda, dalam kompartemen sunselular, atau dalam organisme prokaryotik seperti E coli. :emuan ini diperoleh sebagai hasil penerapan prosedur pemisahan elektroforentik pada pemisahan bentuk-bentuk akti&itas enzimatik tertentu yang berbeda secara elektroforetis. Pe*is$h$n 0$n I0enti3i&$si Isoen/i* *e*i%i&i Ni%$i Di$'nosti& 2sozim laktat dehidrogenase dalam serum dapat dilihat dengan melakukan elektroforesis terhadap sampel serum pada bahan penyangga pati, agar atau gel poliakrilamoda, yang biasanya dilakukan dengan P8 C,;. isozim tersebut mempunyai muatan yang belainan pada p8 C,; ini dan bermigrasi menu!u lima daerah yang berlainan pada elektoferogram. 2sozim tersebut dideteksi berdasarkan kemampuan masing .masing isozim. 'engatalisis proses reaksi suatu zat pewarna yang tidak berwarna men!adi bentuk yang berwarna dan tidak larut. 6ampuran $ssay dehidrogenase tipikal mengandung #$"5 suatu substrat terteduksi , bentuk teroksidasi zat pewarna redoks seperti nitroblue tetrazolium (#):), pembawa (carrier) electron intermediet yang diperlukan bagi pemindahan elektron dari #$"8 ke #):, serta pendapat serta ion pengaktif !ika dibutuhkan..

(C

(4aktat)

S8+

4$%:$: "E82"37>E#$SE

(piru&at)

#$"5

#$"8 5 85

P'S :ereduksi

P'S :eroksidasi

#): :eroksidasi (:idak berwarna)

#): tereduksi (<ormazan )iu)

1$*b$r : reaksi yang dirangkaiakn untuk mendeteksi akti&itas laktat dehidrogenase pada sebuan elektroferogram. (#):, netroblue tetrazolium, P'S, phenazine methosulfate). Iso/i* *eru-$&$n -ro0u& 0$ri 'en y$n' ber&er$b$t er$t# Enzim oligomerik dengan protomer yang tidak sama bisa terdapat. 0ang sering, satu !aringan mengahsilkan terutama satu !enis protomer, sementara !aringan lain menghasilkan protomer lain. )ila protomer-protomer ini dapat brgabung melalui berbagai cara untuk membangun sebuah enzim yang aktif (misal, tetramer), terbentuklah isozim dengan aktifitas enzimatik tersebut. 2sozim laktat dehidrogenase memiliki perbedaan pada tingkat stuktur kuanternernya. 'olekul oligomerik laktat dehidrogenase stuktur kuanternernya. 'olekul oligomerik laktat dehidrogenase (berat molekul (,E.EEE) terdiri atas empat protomer dengan dua tipe, yaitu tipe 8 dan ' (berat molekul sekitar ,-.EEE). hanya molekul tetramiklah yang mempunyai akti&itas katalitik. /ika urutan tidak penting, protomer ini dapt dikambinasikan mela4ui cara berikut * 8888 888' 88''

(D

8''' '''' 'arkert telah menggunakan se!umlah kondisi yang diketahui dapat membongkar dan membentuk kembali struktur kuanterner untuk menerangkan hubungan antar isozim laktat dehidrogenase. Pemecahan dan pembentukan kembali laktat dehidrogenase .2( atatu laktat dehidrogenase .2= homogen tidak emnghasilkan isozim yang baru. (#> ANA!ISIS KUANTITATIF ENZIM P!ASMA TE)TENTU MEMPUN8AI MAKNA DIA1N.STIK# En/i* -%$s*$ non3un'sion$% tidak melakukan sembanrang fungsi fisiologik ynag diketahui di dalam darah. Substrat sering tidak ditemukan di dalam plasma, dan enzim sendiri terdapat di dalam darah manusia normal dengan kadar sampai se!uta kali lipat lebih rendah daripada kadar di !aringan. %eberadaan enzim di dalam plasma dengan kadar yang meningkat diatas nilai normalnya menun!ukkan peningkatan la!u kerusakan !aringan. (#? ENZIM END.NUK!EASE )EST)IKSI MEMFASI!ITASI PENE1AKAN DIA1N.SIS PEN8AKIT 1ENTIK Penegakan diagnosis penyakit genetic telah memperoleh dorongan yang luar biasa dari perkembangan teknologi "#$ rekombinan. 'eskipun semua penyakit molecular telah lama diketahui ter!adi sbagai akibat perubahan "#$, teknik untuk pemeriksan langsung terhadap rangkaian "#$, teknik untuk pemeriksaan langsung terhadap rangkaian "#$ baru belakangan ini tersedia. Pengembangan pelacakan hibridasi untuk fragmen "#$ telah menghasilkan se!umlah teknik penapisan prenatal dengan sensiti&itas yang memedai guna menentukan ada tidaknya kalainan herediter, teknik ini dilakukan dengan memetakan enzim retriksi "#$ yang berasal dari sel-sel !anin dalam cairan amnion atau dengan memeriksa produk yang dihasilkan menggunakan oligonukleotida sebagai senyawa primer untuk re$&si r$nt$i -o%i*er$se7 (P63, polymerase chain reaction). Pada prinsipnya berbagai pelacak terhadap "#$ dapat dilakukan untuk menengakan diagnosis sebagaian besar penyakit genetik. Sebuah pelacak terhadap "#$ yang dibuat terhadap suatu bagian gen untuk sub unit hemoglobin normal dapat mendeteksi fragmen restrisik yang emmendek atau tidak ada akibat delesi di dalam gen tersebut, sebagaiman ter!adi pada sebagian penyakit talasemia-, dan pada tipe-tipe talasemia - serta -, yang langka.

+E

ASI!

DI1ESTI

)EST)IKSI

8AN1

SUDA

TE)!A@AK

DAPAT

MEN1UN1KAPKAN 1EN BE)BEDA#

.M.!.1 DEN1AN )AN1KAIAN BASA

Pelacak "#$ dapat pula digunakan mendeteksi rangkaian "#$ yang behubungan erat dengan gen. Pemeriksaan analisis ini dapat dikembangkan untuk mendeteksi berbagai &ariasi kromosom spesifik (perbedaan dalam rangkaian antar kromosom homolog). "igesti "#$ oleh enzim retriksi endonuklease akan menghasilkan peta restriksi berbeda-beda (pola fragmen "#$) dari gen-gen homologyang mengandung rangkaian basa yang berlainan . fenomena ini diberi nam A-o%i*or3is*e -$n,$n' 3r$'*en restri&siB# )agi penyakit genetic yang berhubungan dengan 3<4P,seorang manusia yang men!adi pembawa penyakit tersebut akan membawa satu kromosom dengan gen normal dan satu kromosom lagi dengan gen cacat. )NA KATA!ITIK 'eskipun !elas bukan merupakan protein, asam ribonukleat (3#$) tertentu akan memperlihatkan akti&itas katalitik yang sangat spesifik bagi substrat tertentu. 3#$ ini yang memenuhi semua kriteria klasik untuk didefinisi sebagai enzim, disebut ribozim. 'eskipun substrat yang dikatalisis oleh ribozim hanya terbatas pada ikatan fosfodiester 3#$, spesifitas ker!anya sepenuhnya sebanding ker!a enzim yang klasik. 3ibozim mengatalisis reaksi trans esrterifikasi dan akhirnya reaksi hidrolisis ikatan fosfodiester dalam molekul 3#$. 3eaksi ini diperlancar oleh gugus 78.

+(

BAB III PENUTUP +#" (. +. ,. KESIMPU!AN Enzim merupakan katalisator yang mengatur kecepata berlangusngnaya berbagai proses fisiologik 6acat pada fungsi enzim sering menyebabkan penyakit Enzim yang mengatalisis reaksi yang melibatkan pemindahan gugus isomerisasi, oksido-reduksi, atau sintesis ikatan ko&alen memerlukan substrat yang dikenal dengan koenzim -. Sebagian besar enzim bersifat sangat spesifik terhadap substratnya, koenzim serta tipe reaksi yang dikatalisisnya. 'eskipun demikian, beberapa enzim protease !uga memecah ester. )agi enzim yang beker!a pada substrat dapat pula ikut bereaksi, tetapi umumnya dengan kecepatan yang lebih rendah. =. ;. Pengukuran akti&itas enzim merupakan hal sentral bagi penentuan kuantitas enzim dalam riset atau laboratorium klinik. $kti&itas enzim dehidrogenase yang bergantung .#$"(P)5 diperiksa secara spektrofotomentris dengan mengukur perubahan absorbsi pada ,,E mm yang menyertai oksidasi atau reduksi #$" (P)8. 9. C. D. Perangkaian enzim lain pada dehidrogenase dapat memperlancar analisisnya. 1ntuk menyelidiki struktur mekanisme ker!a, dan pengaturan akti&itasnya, enzim harus dimurnikan hingga mencapai homogeneitas sekitar D=J. teknik pemurnian enzim mencakup presipitasi selektif dengan pelarut garam atau organic dan kromatografi pada penyangga pertukaran ion, filtrasi gel, afinitas substrat, ligand zat warna, atau interaksi hidrofobik. (E. kemampuan memanfaatkan teknik rekombinan "#$ untuk mengekspresikan enzim dalam tubuh hospes yang dipilih telah membawa re&olusi dalam teknik pemurnian enzim dengan menghasilkan enzim dalan !umalh besar yang dalam sebagian besar keadaan, mudah dimurnikan hingga mencapa homogeneitas. ((. %ema!uan pemurnian dinilai dengan mengukur peningkatan aktifitas spesifik suatu enzim (akti&itas per unit masa) dan homogenitas akhir lewat elektroforesis gel poliakrilamida (P$>E). (+. Penentuan lokasi enzim intrasel yang tepat disimpulkan lewat teknik histokimia dan fraksionasi sel, yang dirangkaiakn dengan analisis enzimatik, terhadap ++

sayatan !aringan atau fraksi homogenat sel, isozim, bentuk yang secara fisik berbeda pada enzim nonfungsional di dalam serum menun!ukan kerusakan pada !aringan tertentu manusia, dan memberikan informasi diagnostik seta prognostic yang berharga. (,. %emampuan enzim restriksi endonuklease mendeteksi perubahan yang sangat kecil pada struktur gen telah memungkinkan dokter mendiagnosis penyakit genetic akibat mutasi yang menghasilkan enzim yang cacat atau enzim nonfungsional. (-. 3#$ katalitik yang dikenl sebagai ribozim mengatalisis reaksi hidrolisis yang sangat spesifik ikatan fosfodiester pada 3#$. 3eaksi ini amat penting dalam berbagai pristiwa pemrosesan yang terlibat di dalam maturasi pra-m3#$ +#( SA)AN Peranan enzim dalam kesehatan sangat penting, untuk itu manusia hendaknya lebih men!aga kesehatan. "an kami penyusun mengharapkan masukan untuk penyempurnaan makalah ini.

+,

KEPUSTAKAAN 'urray, 3obert %, (DD;, 8arperLs, )iochemistry 'c. >il&ery, 3obert M, $nd >erald M, (DC, Page "a&id, (DC(. :riman /r, +EE9 'ateri )iokimia, Surabaya

+-

+=

+;